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异柠檬酸盐脱氢酶（isocitrate dehydrogenase，IDH）是三羧酸循环的限速酶，催化柠檬酸为α酮戊二酸（α-ketoglutarate, α-KG），其家族包括IDH1、IDH2和IDH3三个成员，IDH1定位于细胞质和过氧化物酶体中，IDH2和IDH3定位于细胞线粒体。IDH1和IDH2突变作为急性髓系白血病（AML）进展中早期克隆事件，对AML预后的作用受到突变位点和其他共同发生突变的影响，对12 747例IDH1/2突变患者进行meta分析发现，正常核型急性髓系白血病（CN-AML）患者中IDH1突变者完全缓解率、总生存率和无事件生存率较低，而IDH2突变患者的总生存率较高[1,2,3]。Ward等[4]采用siRNA沉默IDH1基因直接导致神经胶质瘤细胞株SF188细胞生长减慢，证明IDH1抑制神经胶质瘤细胞增殖，而不是抑癌基因。我们前期对320例CN-AML患者研究显示，与IDH1基因mRNA低表达患者相比较，高表达患者预后差，IDH1基因表达水平是独立于WBC、原始细胞比例、染色体核型和基因突变等临床特征的独立预后因素之一[5]。本研究主要探讨IDH1基因影响AML预后的可能机制。
人AML细胞株THP-1细胞购于中国科学院上海细胞生物学研究所，测序证实为IDH1和DIH2野生型，培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的恒温培养箱中培养。取生长状态良好的对数生长期细胞进行实验。
胎牛血清和RPMI 1640培养基购自于美国Gibco公司；噻唑蓝（MTT）购自美国Sigma公司；Annexin Ⅴ/PI细胞凋亡检测试剂盒购自美国Biovision公司；β-actin抗体购自美国Santa Cruz公司；Caspase-3、poly（ADP-ribose）polymerase（PARP）、Cytc、BCL-2、Bak、PI3K、AKT、p-AKT、p-mTOR和p-p70S6K等抗体均购自美国Cell Signaling公司；阿柔比星（ACR）纯品由深圳万乐药业公司赠送，高三尖杉酯碱（HHT）纯品购自浙江省药品检验所，柔红霉素（DNR）纯品购自大连美仑生物科技有限公司；siRNA由美国Invitrogen公司合成，序列见表1；siRNA的阴性对照（negative control，NC）、带红色荧光的阳性对照、LipofectamineTM RNAiMAX转染试剂、Opti-MEM I Medium和RT试剂盒均购自美国Invitrogen公司；RNAiso plus和SYBR Green（SYBR@Premix Ex Taq TM Ⅱ）购自宝生物工程（大连）有限公司；随机引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。
IDH1 siRNA的序列
IDH1 siRNA的序列
| siRNA | 正向引物（5'→3'） | 反向引物（5'→3'） |
|---|---|---|
| IDH1-181 | AAAUGAUUCGUGUCAUUUCAUCUCC | GGAGAUGAAAUGACACGAAUCAUUU |
| IDH1-182 | AAAUCAGUUGCUCUGUAUUGAUCCC | GGGAUCAAUACAGAGCAACUGAUUU |
| IDH1-183 | UUCAAACUGGGACUUGUACUGCUUG | CAAGCAGUACAAGUCCCAGUUUGAA |
取生长状态良好的对数生长期THP-1细胞，875×g离心5 min，弃上清，用含10%FBS的RPMI 1640培养基重悬并计数，调整细胞密度为6×105/ml，铺于24孔板内，每孔500 μl。按照LipofectamineTM RNAiMAX操作说明配制转染混合物。500 μl转染体系的转染混合物的比例如下：混合物1：Opti-MEM I Medium 50 μl，LipofectamineTM RNAiMAX 1 μl，共计51 μl；混合物2：Opti-MEM I Medium 50 μl，siRNA 1 μl（20 nmol/L），共计51 μl。混合物1和混合物2充分混匀后置于室温20 min后，加入已经铺好细胞的24孔板内，轻轻混匀，置于37 ℃、5%CO2培养箱培养。转染后24、48和72 h收集细胞，用流式细胞仪检测转染效率。实验均重复3次。
总RNA抽提按照RNAiso plus说明书进行。cDNA逆转录应用Invitrogen RT试剂盒，根据说明书将1 μg的总RNA逆转录为cDNA。IDH1基因mRNA表达量按SYBR Green（SYBR@Premix Ex Taq TM Ⅱ）PCR Kit说明书操作。以C-ABL基因作为内参，PCR引物序列如下：C-ABL：正向引物5′-TGGAGATAACACTCTAAGCATAACTAAAGGT-3′，反向引物5′-GATGTAGTTGCTTGGGACCCA-3′。IDH1：正向引物5′-TCCCTACGTGGAATTGGATCTACA-3′，反向引物5′-TGCAGCATCCTTGGTGACTTG-3′。冰上配制PCR体系：2×SYBR@ Premix Ex Taq TMⅡ 12.5 μl；上游引物（10 μmol/L）0.25 μl，下游引物（10 μmol/L）0.25 μl，cDNA 1.0 μl，ddH2O 11.0 μl，共25 μl；PCR程序：95 ℃预变性5 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，40个循环。变性、退火、延伸扩增40个循环。制作C-ABL和IDH1熔解曲线，所有引物的熔解曲线为单一熔解峰，均介于75~85 ℃，表明PCR特异性较好。每个样本重复3次，IDH1的相对表达量用2-△△CT计算。
siRNA IDH1-181+182和NC转染THP-1细胞后，细胞密度调整为1.5×104/ml，以每孔200 μl接种于96孔培养板内，设置4个复孔，培养1~7 d。siRNA IDH1-181+182和NC转染THP-1细胞48 h后，收集细胞，密度调整为1×105/ml，以每孔200 μl的体积接种于96孔培养板内，分别加入不同浓度化疗药物HHT（10、20、40、80和160 ng/ml）、ACR（20、40、80和160 ng/ml）和DNR（20、40、60、80和100 ng/ml），对照孔细胞加入相应体积的溶解药物溶剂，毎个浓度设置4个复孔。根据实验要求相应的时间后加入MTT工作液（5 mg/ml），每孔20 μl，充分混匀后置于5%CO2、37℃、饱和湿度的培养箱继续培养4 h。2 189×g离心10 min，弃上清，加入DMSO，每孔200 μl，用Bio-rad酶标仪，检测570 nm吸光度值。实验均重复3次。
按照Annexin Ⅴ/PI检测试剂盒说明进行操作。收集siRNA干扰的THP-1细胞，预冷PBS洗涤2遍，875×g离心5 min，弃去上清；细胞团块重悬于1×结合缓冲液100 μl，将细胞重悬液转移到试管中；分别加入5 μl PI和5 μl Annexin Ⅴ，充分混匀，室温避光反应10 min后上流式细胞仪检测，应用Cellquest 1.2软件分析结果。实验均重复3次。
收集siRNA干扰的THP-1细胞，预冷PBS洗涤2遍，875×g离心5 min，弃去上清；75%酒精重悬细胞，4 ℃固定；预冷PBS洗涤固定好的细胞悬液3遍，弃去上清；1 ml预冷的PBS重悬细胞，加入RNA酶2 μl，37 ℃反应30 min，悬液冷却后加入PI工作液30 μl，避光，4 ℃孵育30 min；用流式细胞仪检测，ModfitLD软件分析细胞周期结果。实验均重复3次。
收集siRNA干扰的THP-1细胞，预冷PBS洗涤3遍，加入细胞裂解液混匀后冰上裂解40 min，离心收集上清，BCA法检测蛋白浓度。以40 μg总蛋白进行SDS-PAGE后转膜至PVDF膜，50 g/L脱脂牛奶室温封闭1 h，一抗4 ℃孵育过夜，次日洗涤后加入相应二抗共孵育l h，洗涤后进行X线胶片显影。
采用SPSS 19.0软件进行数据分析。IC50采用加权直线回归方程计算，常规进行方差齐性和正态性检验。单变量组间比较采用t检验，方差不齐者采用非参数检验。以P<0.05为差异有统计学意义。统计图则采用Graphpad Prism6.0软件进行绘制。
IDH1 siRNA有IDH1-181、IDH1-182和IDH1-183三个片段，三个片段单独应用时IDH1基因mRNA下调水平不理想，将三个片段按不同方式组合，总浓度仍为20 nmol/L，转染THP-1细胞48 h后检测IDH1基因mRNA的表达情况，IDH1-181+183、IDH1-181+182、IDH1-182+183和IDH1-181+182+183组的IDH1基因mRNA抑制率分别为（63.69±7.73）%、（71.64±9.64%）、（64.91±9.79）%和（69.04±5.27）%。因此，选用IDH1-181+182组合进行后续试验。IDH1-181+182转染THP-1细胞48 h后Western blot检测IDH1蛋白表达情况，结果如图1所示，IDH1蛋白表达明显下调，表明THP-1细胞IDH1基因siRNA成功。
1：阴性对照；2：IDH1-181+182干扰组
IDH1-181+182转染THP-1细胞后，MTT法检测THP-1细胞的增殖，结果如图2所示，与NC组相比较，沉默IDH1基因能够抑制THP-1细胞的增殖（t=2.60，P=0.040）。
对干扰细胞进行凋亡检测，结果如图3A所示，干扰72 h后，IDH1-181+182干扰组凋亡率为（37.22±8.27）%，明显高于NC组的（19.50±1.18）%（t=-3.67，P=0.021）。如图3B所示，IDH1-181+182干扰组和NC组G0/G1期细胞的比例分别为（50.05±4.02）%和（50.42±1.23）%，差异无统计学意义（t=0.15，P=0.890）。
采用Western blot法检测干扰48 h THP-1细胞凋亡蛋白的变化，结果如图4所示，与NC组相比较，IDH1-181+182干扰组的Caspase-3和PARP的剪切带明显增加，促凋亡蛋白Bak和Cytc表达水平明显升高，而抗凋亡蛋白BCL-2和IAP家族成员c-IAP1表达水平明显下调。
1：阴性对照；2：IDH1-181+182干扰组
PI3K/AKT信号通路在肿瘤细胞增殖和凋亡中起重要的作用，因此，我们检测沉默IDH1基因48 h THP-1细胞PI3K/AKT信号通路蛋白的变化。结果如图5所示，IDH1-181+182干扰组与NC组相比较，沉默IDH1基因后，PI3K/AKT/mTOR信号通路被抑制，信号通路中的PI3K110α、p-AKT、p-mTOR和p-p70S6K表达均下调。
1：阴性对照；2：IDH1-181+182干扰组
siRNA干扰THP-1细胞48 h后，比较其对化疗药物的敏感性。结果如图6所示，HHT、ACR、DNR分别作用24 h后，与NC组相比较，IDH1-181+182干扰组THP-1细胞生存率降低，差异均有统计学意义（HHT：t=4.8，P=0.005；ACR：t=3.0，P=0.041；DNR：t=3.8，P=0.012）。
A、B、C分别为对高三尖杉酯碱（HHT）、阿柔比星（ACR）、柔红霉素（DNR）敏感性的影响
AML是一组高度异质性的血液系统恶性肿瘤，信号通路的调节紊乱和持续激活促进骨髓造血干/祖细胞的增殖。磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）/雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路在多种肿瘤中被激活，对肿瘤细胞的增殖、凋亡、血管生成和代谢等方面起着重要作用[6]。多项研究显示60%~80%的AML患者PI3K/Akt/mTOR信号通路被激活，这类患者总生存和无事件生存时间短，预后差，PI3K/Akt/mTOR信号通路被作为AML治疗的靶点[7]。
IDH1位于胞质和过氧化物酶体，以NADP+作为辅助因子，催化异柠檬酸的氧化脱羧反应生成α-酮戊二酸和NADPH，激活各种αKG依赖性双加氧酶，并提供还原当量，在脂质生物合成和氧化还原稳态中起重要作用[8]。大量研究证实肿瘤细胞IDH1突变为杂合的点突变，IDH1突变使其获得了新的酶活性，催化α-KG生成2-羟戊二酸（2-HG），其通过竞争性抑制依赖α-KG的酶活性来发挥病理作用。Ward等[9]研究发现突变IDH1细胞胞质2-HG的产生依赖于保留的野生型IDH1等位基因的活性。我们前期对320例CN-AML患者研究显示IDH1基因mRNA高表达者预后差，是CN-AML独立预后因素之一[5]。IDH1基因表达通过何种机制影响AML预后？我们选择AML细胞株中IDH1基因表达量最高，IDH1基因野生型的THP-1细胞作为研究对象，设计siRNA干扰野生型IDH1基因的转录，发现沉默THP-1细胞IDH1基因，细胞增殖受抑制。siRNA干扰野生型IDH1基因抑制AML细胞株THP-1细胞增殖与Ward等[10]采用siRNA沉默胶质瘤细胞株SF188细胞IDH1基因导致细胞增殖减慢和Metallo等[11]采用shRNA沉默肺癌细胞株A549细胞IDH1基因抑制细胞增殖一致。
细胞凋亡和周期阻滞是引起细胞生长抑制的常见原因。我们沉默THP-1细胞IDH1基因诱导细胞发生凋亡，但细胞周期未受影响。细胞凋亡是程序性死亡，细胞受到凋亡信号刺激后，各种Caspase被级联剪切激活是凋亡过程中重要的事件，受凋亡相关蛋白的调控，如BCL-2、BCL-xl、MCL-1等拮抗细胞凋亡，Bax、Bak、Bid等促进细胞凋亡，其中Bax/BCL-2的比例决定细胞凋亡和Caspase激活的级联反应。Western blot检测结果显示siRNA沉默THP-1细胞IDH1基因后抗凋亡蛋白BCL-2下调，而促凋亡蛋白Bak上调，BCL-2和Bax位于线粒体的外膜上，BCL-2下调，导致Bax/BCL-2比例上调，细胞色素C从线粒体释放到胞质中，促进Caspase激活的级联反应，因此，我们检测到Caspase-3及PARP被激活。IAP家族由多个成员组成包括CIAP-1、CIAP-2和XIAP等，结合并抑制caspase的活性来抑制凋亡，Western blot检测结果显示siRNA沉默IDH1基因后THP-1细胞CIAP-1下调，促进细胞凋亡。
PI3K/Akt/mTOR信号通路在60%~80%AML患者中被激活，调控细胞增殖和凋亡。Western blot检测发现siRNA沉默THP-1细胞IDH1基因后PI3K/AKT信号通路被抑制，PI3K110α、p-AKT、p-mTOR和p-P70S6K下调，可能通过抑制PI3K/Akt通路，诱导细胞凋亡，通过PI3K/Akt/mTOR/p70S6K途径抑制蛋白合成和细胞增殖，增加细胞对临床常用化疗药物HHT、ACR和DNR的敏感性。
综上所述，在AML患者中，IDH1基因mRNA高表达患者预后差，IDH1基因可能通过PI3K/AKT途径抑制细胞凋亡和促进细胞增殖。因此，下调AML细胞株THP-1细胞IDH1基因表达能够抑制PI3K/AKT信号通路，诱导细胞凋亡和抑制细胞增殖，增加化疗药物的敏感性。
