探讨一个遗传性凝血因子Ⅴ（FⅤ）缺陷症家系的分子致病机制。
DNA直接测序法分析先证者F5的全部外显子、侧翼序列、5′和3′端非翻译区及家系成员（共3代11人）相应的突变位点区域。通过CAT法检测凝血酶生成量；用ClustalX软件分析突变位点的保守性；用MutationTaster、PolyPhen-2、PROVEAN、LRT和SIFT等在线生物信息学软件预测突变位点对蛋白质功能的影响；用Swiss-PdbViewer软件分析氨基酸突变前后蛋白模型及分子间作用力的变化。
先证者F5第8外显子存在c.1258G>T杂合错义突变（p.Gly392Cys）及第14外显子存在c.4797delG杂合缺失突变，导致框移并产生截断蛋白（p.Glu1572Lys fsX19）；其祖父和父亲存在p.Gly392Cys杂合突变；其外祖母、母亲、小姨母和表妹均存在p.Glu1572Lys fsX19杂合突变。先证者凝血酶生成延迟和达峰时间比值明显增高。保守性分析结果表明，p.Gly392在10种同源物种中位于保守区域。五个在线生物信息学软件对p.Gly392Cys预测均显示为致病的突变，Mutation Taster对p.Glu1572Lys fsX19预测也显示为致病突变。蛋白模型分析显示，Gly392突变为Cys392后可导致原有氢键延长，并形成新的空间位阻，影响蛋白结构的稳定性。
该家系F5第8外显子c.1258G>T杂合错义突变及第14外显子c.4797delG杂合缺失突变可能与该家系FⅤ水平降低有关。
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遗传性凝血因子Ⅴ（FⅤ）缺陷症是一种罕见的常染色体隐性遗传性出血性疾病，发病率约为1/100万[1,2]。主要表现为FⅤ活性（FⅤ∶C）降低以及轻重不一的出血或血栓形成，临床表现严重程度与F5基因突变的类型、数目、位点有关。轻至中度FⅤ缺陷症一般由杂合突变引起，通常无临床症状；重度FⅤ缺陷症一般由纯合子或复合杂合突变引起，临床表现为程度不等的出血（皮肤瘀斑、鼻出血、月经量过多、术后出血等）[3]。因此，分析FⅤ基因突变对遗传性FⅤ缺陷症具有重要意义。本文对1例遗传性FⅤ缺陷症患者及家系成员进行实验室表型和基因分析，初步探讨其分子发病机制。
先证者，女，27岁，汉族，浙江省瑞安市人，因先兆流产于2020年4月入住于我院中医妇科病房行保胎治疗。凝血常规检查发现血浆凝血酶原时间（PT）34.6 s（参考值12.5~14.5 s）、活化部分凝血活酶时间（APTT）103.9 s（参考值27.0~41.0 s），FⅤ∶C 3%（参考值86%~114%）、FⅤ抗原（FⅤ∶Ag）5%（参考值70%~140%），其他凝血指标无异常。先证者肝、肾功能正常，无明显自发性出血症状。家系其他成员均无自发性出血症状。家系图见图1。
选取110名体检健康者作为凝血表型指标对照，其中男76名，女34名，年龄21~48岁，无肝、肾功能异常，无出血及血栓史，无抗凝剂用药史，女性无口服避孕药。本研究通过本院伦理委员会批准（伦理2012-17），所有受试者均签署知情同意书。
采集研究对象外周静脉血2.7 ml，用0.109 mol/L枸橼酸钠溶液1∶9抗凝，3 000 r/min离心15 min后，取上层乏血小板血浆用于凝血指标检测，下层血细胞用于基因组DNA抽提。
PT、APTT、纤维蛋白原（FIB）、FⅤ∶C、凝血因子Ⅱ活性（FⅡ∶C）、凝血因子Ⅶ活性（FⅦ∶C）和凝血因子Ⅹ活性（FⅩ∶C）采用凝固法在法国Stago STA-R全自动血凝仪上测定（配套试剂由法国STAGO公司提供）；FⅤ∶Ag采用酶联免疫双抗体夹心法（纯化的sheep anti-human FⅤ IgG由加拿大Cedarlane Laboratories Limited公司提供）。
选用酚-氯仿法提取先证者及家系成员的外周血基因组DNA，并用DU800核酸蛋白分析仪检测所提取基因组DNA的浓度和纯度（基因组DNA提取试剂盒由北京天根生化公司提供）。
根据F5基因序列（GenBank：AY364535），用Primer Premier 5.0软件分别设计31对引物以覆盖F5基因的所有外显子、5′和3′非翻译区序列、侧翼，引物序列及PCR扩增条件参见文献[4]，引物由上海桑尼生物公司合成。
PCR产物割胶后送上海桑尼生物工程公司纯化后用ABI3730XL型测序仪（美国Applera公司产品）测序。通过Chromas软件与美国NCBI基因库所公布的FⅤ基因序列（GenBank：AY364535）进行比对，查找基因突变的位点，发现错义突变位点后用反向测序予以证实，缺失突变用克隆测序证实。明确先证者基因突变的位点后，再扩增其他家系成员相应突变位点区域并进行测序分析。
参照文献[5]方法。
用ClustalⅩ-2.1-win软件对人类和NCBI数据库中提供的其他9种同源性物种：原鸡（Gallusgallus）、黑猩猩（Pantroglodytes）、猕猴（Macaca mulatta）、家犬（Canislupus familiaris）、牛（Bos Taurus）、小家鼠（Musmusculus）、热带爪蟾（Xenopus tropicalis）、斑马鱼（Danio rerio）和褐家鼠（Rattus norvegicus）的氨基酸序列（https://www.ncbi.nih.gov/homologene/104）进行比对，分析突变氨基酸的保守性。
采用MutationTaster、PolyPhen-2、PROVEAN、LRT和SIFT在线软件分析氨基酸突变前后生物信息学特性；用Swiss-pdb Viewer软件分析FⅤ蛋白模型野生型和突变型局部空间构型及分子间作用力的变化。
先证者PT、APTT明显延长；FⅤ∶C和FⅤ∶Ag较正常对照显著降低。其祖父、外祖母、母亲、父亲、小姨母和表妹的PT、APTT均轻度延长；除表妹外，FⅤ∶C和FⅤ∶Ag均下降至正常对照的一半左右，家系成员的其他凝血指标均无明显异常（表1）。
先证者及家系成员主要凝血指标及基因检测结果
先证者及家系成员主要凝血指标及基因检测结果
| 家系成员 | 年龄（岁） | PT（s） | APTT（s） | FIB（g/L） | FⅡ∶C（%） | FⅦ∶C（%） | FⅩ∶C（%） | FⅤ∶C（%） | FⅤ∶Ag（%） | 第8外显子c.1258G>T | 第14外显子c.4797delG |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 先证者（Ⅲ1） | 33 | 34.6 | 103.9 | 4.20 | 97 | 93 | 89 | 3 | 5 | 杂合子 | 杂合子 |
| 祖父（Ⅰ1） | 79 | 15.3 | 42.7 | 3.91 | 95 | 113 | 98 | 57 | 58 | 杂合子 | 野生型 |
| 祖母（Ⅰ2） | 76 | 13.1 | 35.1 | 3.06 | 100 | 104 | 95 | 107 | 110 | 野生型 | 野生型 |
| 外祖父（Ⅰ3） | 78 | 12.9 | 33.3 | 3.65 | 98 | 114 | 111 | 110 | 124 | 野生型 | 野生型 |
| 外祖母（Ⅰ4） | 76 | 14.1 | 41.9 | 2.98 | 90 | 106 | 94 | 51 | 55 | 野生型 | 杂合子 |
| 父亲（Ⅱ1） | 56 | 14.9 | 45.4 | 2.73 | 102 | 112 | 97 | 49 | 54 | 杂合子 | 野生型 |
| 母亲（Ⅱ2） | 55 | 15.4 | 47.2 | 3.26 | 101 | 98 | 98 | 48 | 46 | 野生型 | 杂合子 |
| 二姨母（Ⅱ3） | 52 | 13.2 | 35.3 | 3.14 | 97 | 91 | 85 | 94 | 101 | 野生型 | 野生型 |
| 小姨母（Ⅱ4） | 50 | 15.1 | 45.6 | 2.84 | 87 | 104 | 89 | 50 | 54 | 野生型 | 杂合子 |
| 小姨夫（Ⅱ5） | 53 | 13.4 | 36.1 | 2.46 | 90 | 97 | 96 | 101 | 107 | 野生型 | 野生型 |
| 表妹（Ⅲ2） | 24 | 16.1 | 46.8 | 2.21 | 93 | 90 | 85 | 89 | 95 | 野生型 | 杂合子 |
| 参考值 | 12.5～14.5 | 27.0～41.0 | 2.00～4.00 | 86～116 | 86～120 | 80～120 | 86～115 | 70～130 |
注：PT：凝血酶原时间；APTT：活化部分凝血活酶时间；FIB：纤维蛋白原；FⅤ∶Ag：凝血因子Ⅴ抗原；FⅡ∶C、FⅦ∶C、FⅩ∶C、FⅤ∶C分别为凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅹ、Ⅴ活性
先证者检出F5基因第8外显子c.1258G>T杂合错义突变（p.Gly392Cys）、第14外显子c.4797delG杂合缺失突变（p.Glu1572Lys fsX19），导致1572位的谷氨酸变成赖氨酸后框移19个氨基酸并在1591位提前出现终止翻译，最终产生截断蛋白。其祖父和父亲检出c.1258G>T杂合错义突变，其外祖母、母亲、小姨母和表妹均检出c.4797delG杂合缺失突变，其余家系成员均为野生型（表1、图2）。
A：先证者c.1258G>T杂合错义突变；B：先证者c.4797delG缺失突变正向测序；C：c.4797delG缺失突变克隆测序；D：第8外显子c.1258野生型；E：第14外显子野生型
先证者的峰高明显降低，凝血酶生成潜力略微降低，峰高比值为29.6%，显著降低；而其延迟时间（lag time）和达峰时间（tt peak）比值分别延长为3.01和2.92；其父母上述指标也均发生不同程度变化（表2、图3）。
遗传性凝血因子Ⅴ缺陷症先证者及其父母凝血酶生成试验结果
遗传性凝血因子Ⅴ缺陷症先证者及其父母凝血酶生成试验结果
| 受检者 | 凝血酶生成潜力比值（%） | 峰值比值（%） | 延迟时间比值 | 达峰时间比值 |
|---|---|---|---|---|
| 先证者（Ⅲ1） | 90.9 | 29.6 | 3.01 | 2.92 |
| 父亲(Ⅱ1) | 92.0 | 45.8 | 2.43 | 2.09 |
| 母亲（Ⅱ2） | 98.4 | 67.0 | 2.34 | 1.98 |
| 参考值 | 86.9～113.1 | 85.3～114.7 | 0.88～1.28 | 0.87～1.15 |
ClustalX软件的保守性分析结果表明，p.Gly392在同源物种间高度保守（图4）。
MutationTaster、PolyPhen-2、PROVEAN、LRT和SIFT五个在线生物信息学软件对p.Gly392Cys预测结果分别为1.00分、1.00分、-7.67分、0.00分和0.00分，均显示为可影响蛋白质功能的致病突变；MutationTaster对p.Glu1572Lys fsX19预测结果为1.00，显示为可影响蛋白质功能的致病突变。突变蛋白质空间结构模型分析显示：野生型FⅤ蛋白的分子模型结构中Gly392与I1e492之间存在1条氢链，当Gly392突变为Cys392时，其分子之间的氢键明显延长，并且Cys392与Tyr368之间产生了空间位阻，使蛋白质结构发生改变，可能导致蛋白质的稳定性下降（图5）。
FⅤ是一种单链糖蛋白，在凝血途径和活化蛋白C介导的抗凝血途径中均起到重要的作用。遗传性FⅤ缺陷症，多数患者血浆FⅤ∶Ag水平和FⅤ∶C平行下降，称为Ⅰ型；少数患者血浆FⅤ∶Ag水平正常或接近正常，而FⅤ∶C明显下降，即为Ⅱ型[6]。本例患者血浆FⅤ∶C和FⅤ∶Ag平行下降，属于Ⅰ型。F5基因位于染色体1q21-25，全长80 kb，包含25个外显子和24个内含子。其中，第1~12外显子编码长28个氨基酸的信号肽和A1-A2区，第13外显子编码完整的B区，第14~25外显子编码A3-C1-C2区。成熟FⅤ蛋白含有2196个氨基酸，FⅤ分子由3个A区、1个B区及2个C区组成，其排列顺序为A1-A2-B-A3-C1-C2[7]，F5基因改变将影响其结构和功能，从而导致FⅤ缺陷症。
目前已发现了约160多种与FⅤ缺陷症有关的基因突变，包括错义突变、无义突变及缺失、插入、剪切位点突变等。错义突变通常引起单个氨基酸置换，影响FⅤ的折叠和构象改变，分泌途径的质量控制系统将其滞留在细胞内，导致细胞内降解和分泌障碍[8]。本研究发现先证者F5第8外显子存在p.Gly392Cys杂合错义突变及第14外显子存在p.Glu1572Lys fsX19杂合缺失突变的复合杂合突变；其祖父和父亲存在p.Gly392Cys杂合错义突变，其外祖母、母亲、小姨母和表妹均存在p.Glu1572Lys fsX19杂合缺失突变。存在不同位点单个杂合突变的家系成员，其FⅤ∶C和FⅤ∶Ag均下降至正常对照的一半左右。从凝血酶生成试验显示，携带单个杂合基因突变位点的家系成员，其凝血酶生成量和凝血酶生成速度均较正常人下降，尤其是同时携带这两个突变位点的先证者，表现为更明显，患者的凝血功能受到较大影响，一定程度上评估了出血风险。本研究中F5基因的p.Gly392Cys突变由傅启华等[9]首次报道，该突变使FⅤ蛋白A2结构域的第392位甘氨酸突变为半胱氨酸。Chen等[10]曾报道，p.Gly392Cys突变会引起半胱氨酸残基的暴露，破坏A2结构域支架，干扰了A2结构域上其他半胱氨酸之间二硫键的形成，从而影响蛋白质结构的稳定性，导致FⅤ蛋白质分泌或稳定性受损。
本研究通过Swiss-Pdb Viewer version软件对p.Gly392Cys突变前后的蛋白结构进行模型分析显示：野生型FⅤ蛋白的分子模型结构中Gly392与I1e492之间存在1条氢链，当Gly392突变为Cys392时，其分子之间的氢键明显延长，并且Cys392与Tyr368之间产生了空间位阻，导致蛋白质的稳定性下降，与上述的报道符合。本研究中的p.Glu1572Lys fsX19杂合缺失突变，使1572位的谷氨酸变成赖氨酸后框移19个氨基酸并在1591位提前出现终止翻译，产生截断蛋白，导致18个氨基酸（1572~1590）被替换和606个氨基酸（1591~2197）丢失，最终使完整的FⅤ蛋白质组装受阻，功能障碍。有研究显示，基因突变后形成结构异常的蛋白质，将会被内质网或蛋白酶体降解途径提前降解，导致血浆中含量降低或活性异常，从而影响其生物学功能[11]。本研究还分析了p.Gly392Cys突变的生物学特性，发现p.Gly392Cys在同源物种间高度保守，说明该位点是FⅤ分子的重要位点，在FⅤ蛋白正常功能的发挥中起重要作用。五个在线生物信息学软件对p.Gly392Cys预测均显示为致病的突变，MutationTaster对p.Glu1572Lys fsX19预测也显示为致病的突变，均可影响蛋白质功能，进一步证实了这两个位点野生型氨基酸在FⅤ蛋白中的重要性。
综上所述，本FⅤ缺陷症家系FⅤ水平降低与p.Gly392Cys杂合错义突变和p.Glu1572Lys fsX19杂合缺失突变有关，其具体的致病机制有待体外表达等试验进一步的探讨。
