再生障碍性贫血（AA）是一种骨髓造血衰竭性疾病，可分为重型AA（SAA）和非重型AA（NSAA）[1,2]。NSAA患者目前尚无一致认可的治疗方案。由于部分NSAA患者可进展为SAA或发生克隆演变，目前国内外学者多提倡给予早期干预[3]。达那唑是人工合成的雄激素类药物，文献报道其单药或联合环孢素A（CsA）治疗AA均有一定疗效，可能具有免疫调节作用[4,5,6,7,8]。司坦唑醇是我国应用广泛的雄激素类药物，目前国际上尚无司坦唑醇治疗AA的临床应用数据。本研究通过分析于我中心采用司坦唑醇或达那唑联合CsA治疗的获得性NSAA患者临床资料，比较司坦唑醇和达那唑在治疗NSAA的疗效及安全性，同时采用流式细胞术检测患者治疗前后CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞（Treg）水平，观察不同治疗方案对患者Treg的影响。
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再生障碍性贫血（AA）是一种骨髓造血衰竭性疾病，可分为重型AA（SAA）和非重型AA（NSAA）[1,2]。NSAA患者目前尚无一致认可的治疗方案。由于部分NSAA患者可进展为SAA或发生克隆演变，目前国内外学者多提倡给予早期干预[3]。达那唑是人工合成的雄激素类药物，文献报道其单药或联合环孢素A（CsA）治疗AA均有一定疗效，可能具有免疫调节作用[4,5,6,7,8]。司坦唑醇是我国应用广泛的雄激素类药物，目前国际上尚无司坦唑醇治疗AA的临床应用数据。本研究通过分析于我中心采用司坦唑醇或达那唑联合CsA治疗的获得性NSAA患者临床资料，比较司坦唑醇和达那唑在治疗NSAA的疗效及安全性，同时采用流式细胞术检测患者治疗前后CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞（Treg）水平，观察不同治疗方案对患者Treg的影响。
回顾性分析自2017年1月至2019年1月于北京协和医院门诊治疗的获得性NSAA患者临床资料，排除至随访截止日期治疗时间不足半年的患者。AA诊断符合《再生障碍性贫血诊断治疗专家共识（2017年版）》[9]标准，严重程度按照Camitta标准[10]判定。PNH克隆阳性定义为流式细胞术CD235a+CD55-/CD235a+CD59-红细胞比例>5%或CD24-/Flear-粒细胞比例>5%（10 000个有核细胞）。本研究经北京协和医院伦理委员会批准。
根据治疗方案不同将患者分为3组：① CsA单药组：CsA 3~5 mg·kg-1·d-1，分两次间隔12 h口服，维持CsA血药浓度150~250 μg/L。② CsA联合司坦唑醇组：司坦唑醇2 mg，每日3次口服；CsA治疗剂量同上。③ CsA联合达那唑组：达那唑200 mg，每日3次口服；CsA治疗剂量同上。
AA治疗反应评价标准参考《2015英国血液学标准委员会指南》[11]，包括完全治疗反应（CR）、部分治疗反应（PR）、无治疗反应（NR），CR和PR为有效（OR）。不良反应分级参考国际通用不良反应分级（CTCAE）3.0版。伴有血清丙氨酸转氨酶（ALT）或血清总胆红素（TBIL）增高者被认为存在肝功能异常。ALT增高程度定义：轻度，40 U/L~≤100 U/L；中度，100 U/L~≤200 U/L；重度，ALT>200 U/L。TBIL增高程度定义：轻度，17.1 μmol/L~≤34.2 μmol/L；中度，34.2 μmol/L~≤51.3 μmol/L；重度，TBIL>51.3 μmol/L。肾功能不全程度以肾小球滤过率（GFR）表示：轻度，≥60 ml/min/1.73m2~90 ml/min/1.73m2；中度，≥30 ml/min/1.73m2~60 ml/min/1.73m2；重度，GFR<30 ml/min/1.73m2。
收集患者治疗前及治疗后6个月新鲜抗凝静脉血2 ml，流式细胞术检测CD4+CD25+Foxp3+ Treg比例，比较不同方案治疗前后Treg水平变化，并收集6例健康志愿者静脉血标本作为正常对照。
采用SPSS 22.0软件进行数据描述及统计分析。符合正态分布的计量资料采用均数±标准差表示，组间比较采用t检验或方差分析。不符合正态分布的计量资料采用中位数（范围）表示，组间比较采用非参数检验。计数资料采用百分比表示，不同治疗方案疗效比较采用Pearson卡方检验或Fisher精确概率法，组内两两比较采用bofferoni校正。治疗前后患者Treg比例比较采用配对秩和检验。
本研究共纳入74例NSAA患者，其中男32例（43.2%），女42例（56.8%），中位年龄40（14~68）岁。CsA联合司坦唑醇治疗组40例（54.1%），CsA联合达那唑治疗组14例（18.9%），CsA单药治疗组20例（27.0%）。各组患者基线特征及随访时间差异均无统计学意义（P>0.05）（表1）。
三种不同方案治疗组获得性NSAA患者基线特征及随访时间比较
三种不同方案治疗组获得性NSAA患者基线特征及随访时间比较
| 变量 | CsA+司坦唑醇(40例) | CsA+达那唑(14例) | CsA单药(20例) | P值 | |
|---|---|---|---|---|---|
| 性别[例(%)] | 0.357 | ||||
| 男 | 20(50.0) | 4(28.6) | 8(40.0) | ||
| 女 | 20(50.0) | 10(71.4) | 12(60.0) | ||
| 年龄[岁，M（范围）] | 41(14~67) | 42.5(15~68) | 45.5(38~61) | 0.524 | |
| 初诊时外周血细胞计数 | |||||
| ANC[×109/L，M（范围）] | 1.2(0.7~3.8) | 2.3(0.7~4.8) | 1.4(0.3~4.5) | 0.153 | |
| HGB[g/L,M（范围）] | 85(52~125) | 116(45~152) | 93(47~133) | 0.144 | |
| PLT[×109/L，M（范围）] | 31(5~229) | 27(4~32) | 23(6~56) | 0.314 | |
| Ret[×109/L，M（范围）] | 36.3(23.1~58.0) | 36.8(26.7~51.1) | 37.3(20.4~54.9) | 0.301 | |
| PNH克隆阳性[例(%)] | 2(5.0) | 0(0) | 2(10.0) | 0.793 | |
| 随访时间[月，M（范围）] | 16.5(9~28) | 17(6~20) | 15(12~24) | 0.832 | |
注：NSAA：非重型再生障碍性贫血；CsA：环孢素A；ANC：中性粒细胞绝对计数；Ret：网织红细胞绝对计数；PNH：阵发性睡眠性血红蛋白尿
中位随访16.5（6~28）个月，74例患者均经历了至少半年的治疗。40例接受CsA联合司坦唑醇治疗的患者中，CR 12例（30.0%），PR 16例（40.0%），OR率为70.0%。14例接受CsA联合达那唑治疗的患者中，CR 4例（28.6%），PR 4例（28.6%），OR率为57.2%。20例接受CsA单药治疗的患者中，CR 2例（10.0%），PR 6例（30.0%），OR率为40.0%。三组患者OR率、CR率两两比较差异均无统计学意义（P值均>0.017）。CsA联合司坦唑醇治疗组患者红系治疗反应率为60.0%，高于CsA联合达那唑治疗组（28.6%）（P=0.063>0.017）及CsA单药治疗组（20.0%）（P=0.006）；CsA联合司坦唑醇治疗组与CsA联合达那唑治疗组患者粒系治疗反应相当（55.0%、57.1%，P=1.000），高于CsA单药治疗组的25.0%（P=0.032，P=0.080）；三组血小板治疗反应率分别为45.0%、57.1%、40.0%，两两比较差异均无统计学意义。三种不同治疗方案中位起效时间分别为3（1~8）、2.5（2~6.5）、3.3（1.5~5.5）个月，两两比较差异均无统计学意义，其3个月及6个月OR率分别为45.0%、28.6%、10.0%及65.0%、42.9%、40.0%。
最常见的不良反应为肾功能异常（44.6%，33/74），其中仅2例（2.7%）患者因重度肾功能不全而换用其他治疗方案，其余患者经CsA减量后肾功能好转。肝功能异常发生于约20%患者中，其中ALT增高者占16.2%（12/74），胆红素增高者占18.9%（14/74），均为轻中度增高，经对症治疗后好转。其他较少见不良反应包括女性月经紊乱（16.7%）、胃肠道反应（12.2%）、毛发增多（10.8%）、肌痛/肌肉震颤（8.1%）、齿龈增生（5.4%）、痤疮（2.7%）等，经对症治疗或短暂停药后好转，三组患者不良反应比较差异均无统计学意义（表2）。
三种不同方案治疗组获得性NSAA患者不良反应发生率比较[例（%）]
三种不同方案治疗组获得性NSAA患者不良反应发生率比较[例（%）]
| 不良反应 | CsA+司坦唑醇(40例) | CsA+达那唑(14例) | CsA单药(20例) | P值 | |
|---|---|---|---|---|---|
| 肾功能不全 | 18(45.0) | 8(57.1) | 7(35.0) | 0.440 | |
| 轻 | 10(25.0) | 4(28.6) | 4(20.0) | ||
| 中 | 7(17.5) | 4(28.6) | 2(10.0) | ||
| 重 | 1(2.5) | 0(0) | 1(5.0) | ||
| ALT增高 | 8(20.0) | 2(14.3) | 2(10.0) | 0.598 | |
| 轻 | 5(12.5) | 1(7.1) | 1(5.0) | ||
| 中 | 3(7.5) | 1(7.1) | 1(5.0) | ||
| 血清胆红素增高 | 8(20.0) | 4(28.6) | 2(10.0) | 0.383 | |
| 轻 | 6(15.0) | 2(14.3) | 2(10.0) | ||
| 中 | 2(5.0) | 0(0) | 0(0) | ||
| 女性月经紊乱a | 3(15.0) | 2(20) | 1(8.3) | 0.733 | |
| 胃肠道反应 | 5(12.5) | 2(14.3) | 2(10.0) | 0.927 | |
| 毛发增多 | 5(12.5) | 2(14.3) | 1(5.0) | 0.608 | |
| 肌痛、肌肉震颤 | 3(7.5) | 0(0) | 1(5.0) | 0.563 | |
| 齿龈增生 | 2(5.0) | 1(7.1) | 1(5.0) | 0.950 | |
| 痤疮 | 2(5.0) | 0(0) | 0(0) | 0.417 | |
| 癫痫发作 | 0(0) | 0(0) | 1(5.0) | 0.230 | |
注：CsA：环孢素A；NSAA：非重型再生障碍性贫血；a：CsA+司坦唑醇、CsA+达那唑、CsA单药治疗组分别有20、10及12例女性患者
74例患者中，我们共获取19例患者治疗前及治疗半年后静脉血标本。其中，CsA+司坦唑醇治疗者12例，CsA+达那唑治疗者4例，CsA单药治疗者3例。同期检测6例健康志愿者Treg/CD4+ T细胞比例作为正常对照，其中，男2例，女4例，中位年龄36（26~55）岁。19例患者治疗前Treg/CD4+ T细胞比例为2.7%（1.4%~5.0%），显著低于正常对照的4.7%（3.7%~6.3%）（P=0.010）。经过不同方案治疗半年后，10例患者Treg比例增高[1.35%（0.5%~1.9%），P<0.001]。其中CR 5例（50.0%），PR 3例（30.0%），OR率为80.0%。9例不伴有Treg比例增加的患者中，CR 2例（22.2%），PR 3例（33.3%），OR率为55.5%。配对比较显示CsA+司坦唑醇治疗能上调NSAA患者Treg细胞水平[2.25%（1.6%~5.0%）对3.45%（1.5%~5.3%），P=0.059]。4例经CsA+达那唑治疗的患者，3例治疗后Treg比例增高[4.0%（2.2%~4.9%）对4.05%（3.3%~5.4%），P=0.715]，而3例经CsA单药治疗的患者均出现了Treg比例下降[2.8%（1.4%~4.5%）对1.8%（1.0%~3.6%），P=0.109]（图1）。
A：环孢素A（CsA）联合司坦唑醇治疗组；B：CsA联合达那唑治疗组；C：CsA单药治疗组
早在20世纪中期，雄激素就被用于骨髓衰竭性疾病的促造血治疗。随着我们对AA发病机制的深入了解，免疫抑制治疗已成为AA治疗的基石。近年来，TPO受体激动剂艾曲波帕（Eltrombopag）在促造血方面显示出较好疗效，并逐渐为临床所应用[12,13,14]。尽管如此，由于雄激素类药物价格低廉，易于获取，仍处于临床促造血药物的主流地位。本研究回顾了我中心采用CsA联合司坦唑醇或达那唑以及CsA单药治疗的获得性NSAA患者临床数据，共纳入74例接受至少半年治疗的患者，结果显示CsA联合司坦唑醇或达那唑治疗的患者OR率均高于CsA单药治疗患者，肯定了CsA联合雄激素在NSAA治疗中的积极作用。
关于达那唑在AA中的应用，既往研究有较多报道。一项单中心回顾性研究显示，达那唑单药一线治疗获得性AA的有效率可达46%，CR率27%，5年生存率为41%[4]。另一项研究采用CsA联合达那唑治疗34例NSAA患者，其OR率为58.6%[15]，其他研究也采用CsA+达那唑+ATG±G-CSF的多药联合方案，其有效率为50%~60%[16,17]。本研究中，我们采用CsA+达那唑治疗的获得性NSAA患者的OR率为57.2%，与既往研究一致。王书春等[18]报道了采用司坦唑醇治疗的114例儿童NSAA患者，其1年CR率可达13.3%，5年生存率为100.0%。中国医学科学院血液病医院宋琳等[19]采用CsA+司坦唑醇治疗的输血依赖NSAA患者的半年OR率达55.8%，本研究中CsA+司坦唑醇治疗NSAA患者的半年OR率为65.0%，略高于既往报道。值得注意的是，本研究中，虽然相对于CsA+达那唑，CsA联合司坦唑醇治疗NSAA患者OR率差异无统计学意义，但其在促红系造血中却具有优势。提示贫血症状负荷重的NSAA患者可能更能从CsA联合司坦唑醇治疗中获益。因为对于NSAA患者，最常见的主诉为贫血所致乏力症状，也是影响其生活质量的重要因素[20]。
CD8+ T细胞异常扩增与活化介导了获得性AA造血干细胞损害[21]，而伴有Foxp3高表达的Treg能够调节T细胞分化并抑制活化CD8+ T细胞的细胞毒作用，对于维持T细胞系统正常功能具有重要作用[22]。Shi等[23]研究证实获得性AA患者骨髓及外周血Treg比例均显著下降，且存在功能受损，对细胞毒性T细胞抑制能力减弱。本研究结果显示NSAA患者外周血CD4+CD25+Foxp3+ Treg比例明显低于健康对照者，与上述研究结果一致。同时，治疗后Treg比例增加的患者OR率高于Treg比例未增加者，提示以上调Treg为靶向的治疗或许能增加AA患者获益。由于Treg细胞正常数量及功能的维持依赖持续性IL-2表达，而钙调磷酸酶抑制剂能显著抑制T细胞IL-2表达[23]。目前体内外研究多认为CsA对Treg具有抑制作用[25,26]。本研究中，3例采用CsA治疗的NSAA患者均出现Treg细胞比例的下降，在一定程度上支持上述观点。而联合司坦唑醇治疗后，患者Treg比例较治疗前显著增加，支持司坦唑醇对NSAA患者Treg细胞的积极作用。由于样本量限制，本研究中，仅4例采用CsA+达那唑治疗的患者进行了治疗前后Treg检测，其中3例患者出现Treg比例的增高，也在一定程度上支持了达那唑对增加Treg的积极作用。我们推断，联合司坦唑醇和达那唑治疗能弥补CsA对NSAA患者Treg的抑制作用，在发挥免疫抑制作用的同时增加患者免疫耐受能力。
综上，本研究首次比较了司坦唑醇和达那唑在NSAA中的疗效，研究结果提示司坦唑醇在NSAA治疗中具有积极作用，其疗效不亚于达那唑，且在促红系治疗反应中更具优势。获得性NSAA患者外周血Treg水平低于健康对照者，而相较于CsA单药，CsA联合司坦唑醇或达那唑治疗能上调患者Treg水平，提示司坦唑醇和达那唑可能是通过免疫调节效应发挥积极治疗作用。值得注意的是，由于本研究为回顾性研究，患者治疗选择存在一定程度偏倚。且本研究样本数量有限，研究结论尚需进一步前瞻性随机对照临床试验证实。
所有作者声明无利益冲突
