制备一种靶向LMP1抗原的嵌合抗原受体T细胞（CAR-T细胞），研究其对EB病毒（EBV）阳性淋巴瘤的免疫治疗作用。
应用分子克隆技术构建二代LMP1 CAR表达质粒，通过慢病毒包装体系包装病毒后感染人T细胞，获得LMP1 CAR-T细胞，体外实验验证LMP1 CAR-T细胞对感染EBV后的LMP1阳性淋巴瘤细胞的特异性细胞毒性作用。
①LMP1蛋白表达于EBV阳性的淋巴瘤细胞表面；②成功构建了二代LMP1 CAR慢病毒载体，感染人T细胞，获取LMP1 CAR-T细胞，感染效率大于80%；③LMP1 CAR-T细胞可特异性杀伤LMP1阳性淋巴瘤细胞，当效靶比按4∶1共培养48 h后，LMP1 CAR-T细胞对Raji细胞的杀伤作用增强，对Ramos细胞无明显杀伤作用；④与LMP1阳性淋巴瘤细胞按1∶1共培养5 h后，LMP1 CAR-T细胞处理组CD107a+ T细胞比例显著高于Vector-T细胞组[（13.25±2.94）%对（1.55±0.05）%，t＝3.972，P＝0.017]，脱颗粒效果增强；⑤与LMP1阳性淋巴瘤细胞共培养后，LMP1 CAR-T细胞组CD69+、CD25+ T细胞比例显高于Vector-T细胞组[（7.40±0.41）%对（3.48±0.47）%，t＝6.268，P＝0.003；（73.00±4.73）%对（57.67±2.60）%，t＝2.842，P＝0.047]，活化效应增强。⑥与LMP1阳性淋巴瘤细胞共培养后，LMP1 CAR-T细胞组细胞因子分泌增强，高于Vector-T细胞组[IFN-γ：（703±73）ng/L对（422±87）ng/L，t＝2.478，P＝0.068；TNF-α：（215±35）ng/L对（125±2）ng/L，t＝2.536，P＝0.064]。
该研究证实EBV阳性淋巴瘤细胞表面可特异表达LMP1蛋白，成功构建了LMP1 CAR慢病毒载体并感染人T细胞，成功获得LMP1 CAR-T细胞。体外实验证实：与LMP1阳性淋巴瘤细胞共培养后，LMP1 CAR-T细胞脱颗粒效果增强，活化效应增强，高效分泌细胞因子，可特异杀伤LMP1阳性淋巴瘤细胞，具有潜在的临床应用前景。
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EB病毒（EBV）是一种双链DNA病毒，属于人类疱疹病毒，人群感染率高达90%[1]，是WHO发布的Ⅰ级致癌物[2]。该病毒感染人体后，可引发EBV相关的恶性疾病[3]。LMP1蛋白是一种六次跨膜的Ⅱ型跨膜蛋白，有386个氨基酸分子[4]，是一种EBV慢性潜伏感染时特异性表达的膜抗原，在移植后淋巴细胞增殖性疾病、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、T/NK T细胞淋巴瘤、Burkitt淋巴瘤、胃腺癌及鼻咽癌中均可表达[5,6]。
迄今为止，针对EBV感染相关的疾病治疗方法众多，包括抗病毒药物，免疫佐剂，回输EBV特异性细胞毒性T细胞等[7]。但这些治疗手段疗效十分有限，仍需探索新的治疗方法。嵌合抗原受体T细胞（CAR-T细胞）免疫疗法是近年来一项新兴的免疫疗法[8]。该治疗方法通过基因重组的方式，将识别肿瘤相关抗原的单链抗体、铰链与跨膜区、胞内信号域与共刺激分子进行重组，通过慢病毒转染体系包装，感染患者自身的T细胞，获得表达抗肿瘤抗原的单链抗体的T细胞，经过大规模扩增后再回输至患者体内，可以实现靶向消除肿瘤的目的[9]。
本研究中，针对EBV阳性淋巴瘤靶向特异表达的LMP1抗原，我们制备了LMP1 CAR-T细胞进行研究，通过体外试验，初步验证了LMP1 CAR-T细胞抗EBV阳性淋巴瘤的作用。
Burkitt淋巴瘤细胞系Raji细胞为本实验室保存，人B淋巴细胞瘤细胞系Ramos细胞购买于国家生物医学实验细胞资源库，均培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中。健康成人外周血标本取自天津市血液中心，人T细胞通过RossetteSep T细胞富集试剂、Ficoll淋巴细胞分离液富集纯化后，培养于含5%胎牛血清和50 IU IL-2的KBM581培养基中。以上细胞都培养在37 ℃、5%CO2环境中。
蛋白电泳凝胶试剂盒购于中国达科为生物工程有限公司；4%多聚甲醛购于中国碧云天公司；人IFN-γ、TNF-α ELISA试剂盒购于德国Novus公司；APC抗人Fab抗体、PE抗人CD107a抗体、APC抗人CD3抗体、PE抗人CD19抗体、PE抗人CD69抗体、PE抗人CD25抗体购于美国Biolegend公司；PE鼠抗人IgG Fc抗体购于美国Jackson Immuno公司；抗人LMP1[H3]IgG1购于英国Absolute Antibody公司；RossetteSep T细胞富集试剂购于美国Stem Cell公司；人T细胞激活因子CD3/CD28磁珠购于美国Gibco公司；细胞因子IL-2购自美国R&D公司；DMEM、RPMI 1640培养基购于美国Gibco公司；KBM581培养基购于美国Corning公司。
使用蛋白电泳凝胶试剂盒配胶，取Raji和Ramos细胞各1×106于1.5 ml EP管中，裂解煮沸后上样，经电泳、湿转、封闭后，再孵育一抗、二抗，最后化学显影。
使用4%多聚甲醛常温固定10 min，再用抗人LMP1 IgG1抗体室温孵育40 min，之后使用PE标记的抗人IgG Fc 4 ℃孵育30 min，用流式细胞仪检测LMP1表达。
通过中国专利库，查询得到靶向LMP1抗原的人源scFv核苷酸序列（专利号：CN 109400712 A），按照先可变区轻链后重链顺序排列，进一步优化CAR结构中anti-LMP1 scFv结构，通过分子克隆技术构建二代LMP1 CAR载体。
LMP1 CAR质粒、Vector（pCDH-GFP）质粒与慢病毒包装质粒PMD2.0G、JA3、JA4共同转染HEK-293T细胞，待48 h后收集病毒上清，将病毒超速离心浓缩后，分装冻存-80 ℃冰箱备用。
浓缩后的病毒感染经CD3/CD28磁珠刺激活化的T细胞，4 d后使用抗人IgG F（ab'）2抗体标记T细胞表面scFv，应用流式细胞仪检测CAR的表达效率。
LMP1 CAR-T、Vector-T细胞按照效靶比4∶1和8∶1分别与LMP1阳性的Raji细胞或LMP1阴性的Ramos细胞37 ℃、5% CO2共培养24、48 h，由于Raji与Ramos细胞稳定表达CD19抗原，且CD19抗原阳性率都高于99%，使用流式细胞术检测靶细胞中CD19阳性残余细胞比例作为肿瘤细胞残余比例。
LMP1 CAR-T、Vector-T细胞按照效靶比1∶1分别与LMP1阳性的Raji细胞或LMP1阴性的Ramos细胞37 ℃、5% CO2共培养5 h，流式细胞术检测T细胞中CD107a+ T细胞比例，通过CD107a+/CD3+比例反映T细胞激活率。
LMP1 CAR-T、Vector-T细胞按照效靶比1∶1分别与LMP1阳性的Raji细胞或LMP1阴性的Ramos细胞37 ℃、5% CO2共培养8、48 h，流式细胞术检测T细胞中CD69阳性或CD25阳性细胞比例，反映T细胞活化率。
LMP1 CAR-T、Vector-T细胞按照效靶比4∶1分别与LMP1阳性的Raji细胞或LMP1阴性的Ramos细胞共培养，培养条件为37 ℃，5% CO2，共培养48 h后，收集上清，使用ELISA试剂盒检测上清内IFN-γ、TNF-α表达情况。
采用GraphPad Prism 8软件进行统计学分析。结果以均数±标准差表示，组间比较采用独立样本t检验分析。
LMP1抗原结构见图1A，Western blot及流式细胞术结果证实EBV阳性Raji细胞表达LMP1蛋白，而EBV阴性Ramos细胞不表达LMP1蛋白（图1B、1C）。
A：LMP1蛋白结构示意图；B：Western blot检测LMP1蛋白表达；C：流式细胞术检测LMP1蛋白表达
LMP1 CAR载体示意图见图2A。分选的健康人外周血CD3+ T细胞用抗人CD3/CD28磁珠刺激培养，24 h后感染慢病毒体系包装的二代LMP1 CAR表达载体，从而获得LMP1 CAR-T细胞，通过使用IgG Fab抗体标记LMP1 CAR-T细胞表面表达的抗LMP1抗原的scFv，测得LMP1 CAR表达载体的感染效率可达到80%。培养12 d后LMP1 CAR-T细胞可扩增至100倍（图2B）。
A：LMP1 CAR结构示意图；B：LMP1 CAR-T细胞体外扩增曲线
LMP1 CAR-T、Vector-T细胞分别与Raji细胞或Ramos细胞以效靶比4∶1和8∶1共培养24、48 h，流式细胞术检测共培养体系中残余靶细胞比例，以此反映LMP1 CAR-T细胞的杀伤能力。结果显示，与Raji细胞共培养24 h，Vector-T细胞对Raji细胞无明显杀伤作用，而LMP1 CAR-T细胞具有明显的杀伤作用。与Raji细胞共培养48 h，与Vector-T细胞相比，LMP1 CAR-T细胞杀伤作用更加显著。而与Ramos细胞共培养时，LMP1 CAR-T细胞与Vector-T细胞不能有效杀伤肿瘤细胞（图3）。结果表明，LMP1 CAR-T细胞对Raji细胞具有特异性杀伤作用，而对Ramos细胞无杀伤作用。
A：效靶比4∶1与Raji细胞共培养；B：效靶比8∶1与Raji细胞共培养；C：效靶比4∶1与Ramos细胞共培养；D：效靶比8∶1与Ramos细胞共培养
将LMP1 CAR-T细胞与Raji或Ramos细胞按效靶比1∶1共培养5 h，流式细胞术检测CD107a+ T细胞在T细胞中的比例。结果显示，在Raji细胞中，LMP1 CAR-T细胞处理组CD107a+ T细胞比例显著高于Vector-T细胞组[（13.25±2.94）%对（1.55±0.05）%，t＝3.972，P＝0.017]；而在Ramos细胞中，LMP1 CAR-T细胞组CD107a+ T细胞比例高于Vector-T细胞组[（9.44±1.92）%对（0.97±0.18）%，t＝4.401，P＝0.046]，但仍低于LMP1 CAR-T细胞与Raji细胞共培养组。提示与特异性抗原的靶细胞共培养5 h后，LMP1 CAR-T细胞显著提高T细胞激活率，脱颗粒效果增强，有利于更好地发挥抗肿瘤的效果。
将LMP1 CAR-T细胞、Vector-T细胞分别与LMP1阳性Raji细胞、LMP1阴性Ramos细胞按效靶比1∶1共培养8 h，检测早期活化标志CD69+ T细胞比例；共培养48 h，检测晚期活化标志CD25+ T细胞比例。结果显示，LMP1 CAR-T细胞与Raji细胞共培养后，CD69+、CD25+ T细胞比例显著高于Vector-T细胞组[（7.40±0.41）%对（3.48±0.47）%，t＝6.268，P＝0.003；（73.00±4.73）%对（57.67±2.60）%，t＝2.842，P＝0.047]。与Ramos细胞共培养后，LMP1 CAR-T细胞组与Vector-T细胞组CD69+、CD25+ T细胞比例差异无统计学意义[（1.99±0.43）%对（1.89±0.48）%，t＝0.155，P＝0.884；（58.00±3.51）%对（50.00±1.00）%，t＝2.191，P＝0.094]。提示，与特异性抗原的靶细胞共培养后，活化的LMP1 CAR-T细胞比例增高。
将LMP1 CAR-T细胞、Vector-T细胞分别与LMP1阳性Raji细胞、LMP1阴性Ramos细胞按效靶比4∶1共培养48 h后，ELISA法检测细胞因子IFN-γ、TNF-α的表达情况。结果显示，在Raji细胞共培养体系中，LMP1 CAR-T细胞组IFN-γ、TNF-α表达水平均高于Vector-T细胞组[（703±73）ng/L对（422±87）ng/L，t＝2.478，P＝0.068；（215±35）ng/L对（125±2）ng/L，t＝2.536，P＝0.064]，在0.07的水平上有统计学意义；而在Ramos细胞共培养体系中，LMP1 CAR-T细胞组与Vector-T细胞组IFN-γ、TNF-α表达水平差异无统计学意义[（220±57）ng/L对（169±28）ng/L，t＝0.799，P＝0.469；（82±32）ng/L对（55±12）ng/L，t＝0.769，P＝0.485]。反映出与LMP1阳性淋巴瘤细胞共培养时，LMP1 CAR-T细胞抗肿瘤活性增强。
自EBV首次通过电镜从非洲Burkitt淋巴瘤细胞中发现至今已经60余年[10]，临床治疗上EBV阳性的淋巴瘤还是以化疗与放疗联合治疗为主，联合治疗霍奇金淋巴瘤的5年生存率为80%~90%，但该方式易导致严重长期毒性，包括继发性恶性肿瘤、心肺毒性、甲状腺功能减低、不孕症等不良反应，且对于治疗后复发的患者预后不佳[11]。近年来，免疫检查点抑制剂在临床上逐见成效，如PD-1可有效改善患者免疫抑制的情况[12]，体外扩增患者来源的EBV特异性T细胞再回输的治疗方式也同样有效，特别是针对淋巴细胞增殖性疾病[13]。然而，这些治疗方法仍然无法满足全面、有效治疗的需求。
CAR-T细胞免疫治疗是一种可以实现靶向抗肿瘤的治疗方式[14]。EBV感染人体后，感染的B细胞和扁桃体上皮细胞在慢性潜伏期均可表达EBV相关遗传物质[15]，此前已有针对鼻咽癌的LMP1 CAR-T研究[16]，此外，还有针对鼻咽癌的LMP2a CAR-T[17]、针对EBV感染的gp-350 CAR-T[18]等研究（表1）。这些CAR-T细胞都取得不错的抗肿瘤效果，但与靶向病毒颗粒蛋白gp350相比，靶向潜伏膜蛋白的CAR-T细胞治疗安全性更好。
靶向EB病毒（EBV）阳性疾病的嵌合抗原受体T细胞（CAR-T细胞）治疗策略
基于以上研究背景，本研究的创新之处在于将EBV感染后特异性表达的LMP1抗原作为靶点，结合CAR-T靶向治疗的治疗方式，验证靶向EBV阳性的淋巴瘤的治疗作用。
综上，我们成功构建了LMP1 CAR表达载体，LMP1 CAR的表达效率达到80%以上，制备出LMP1 CAR-T细胞，并通过将LMP1 CAR-T细胞与LMP1阳性淋巴瘤细胞共培养的方式，证实了LMP1 CAR-T细胞可被特异性激活、高效分泌细胞因子，对LMP1阳性淋巴瘤具有明显抗肿瘤能力，且对LMP1抗原阴性淋巴瘤无明显特异杀伤能力，表现出一定的安全性，为未来临床治疗EBV阳性淋巴瘤提供新的治疗思路。
所有作者声明无利益冲突
