探索如何提高华氏巨球蛋白血症（WM）患者MYD88突变检测的阳性率和准确率。
回顾性分析2017年6月至2021年6月上海交通大学医学院附属瑞金医院66例初诊WM患者MYD88突变检测结果，分析不同方法和标本检测MYD88突变的阳性率和准确率。
66例WM患者中51例MYD88突变阳性，整体阳性率77%。根据检测方法分类：二代测序（NGS）和等位基因特异性PCR（AS-PCR）检测突变阳性率显著高于一代测序Sanger法（84%对71%对46%，P<0.05）。根据标本取材部位分类：淋巴结和骨髓标本检测突变阳性率显著高于外周血标本（79%对84%对52%，P<0.05）。NGS检测淋巴结、骨髓和外周血MYD88突变阳性率分别为86%、90%和67%。AS-PCR检测淋巴结、骨髓和外周血MYD88突变阳性率分别为78%、81%和53%。39例WM患者进行≥2次MYD88突变检测，以每例患者最终突变检测结果作为标准，判断不同方法和标本的准确率。淋巴结（18例）和骨髓（13例）NGS检测准确率显著高于外周血（4例）标本（100%对100%对75%，P<0.05）。淋巴结（15例）、骨髓（11例）和外周血（16例）AS-PCR检测准确率的差异无统计学意义（93%对91%对88%，P>0.05）。
在检测WM患者MYD88突变情况方面，NGS或AS-PCR法优于Sanger法，淋巴结和骨髓标本优于外周血标本。
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华氏巨球蛋白血症（WM）是一种分泌单克隆IgM的惰性淋巴浆细胞淋巴瘤，在非霍奇金淋巴瘤中占2%[1]。WM病程长，疾病易发生进展，影响患者的生活质量和预后。国外文献报道，90%的WM患者伴MYD88L265P突变，国内关于WM患者MYD88突变检测的报道较少，且各中心报道的突变率不一致[2]。Treon等[3]报道，布鲁顿酪氨酸激酶抑制剂（BTKi）单药的疗效与MYD88及CXCR4突变状态有关。MYD88MUTCXCR4WT患者预后最佳，其次是MYD88MUTCXCR4MUT，MYD88WTCXCR4WT患者预后最差。基于MYD88突变在WM诊断和BTKi疗效判断中的价值，本中心通过不同方法和标本检测66例WM患者MYD88突变情况（部分患者通过不同方法和标本进行多次检测），初步探索如何提高MYD88突变检测阳性率和准确率。
1．一般资料：回顾性分析2017年6月至2021年6月上海交通大学医学院附属瑞金医院进行MYD88突变检测的66例初诊WM患者。所有患者符合以下WM诊断标准：①血清中存在单克隆IgM；②病理检查证实骨髓中存在淋巴浆细胞浸润；③除外其他已知类型的淋巴瘤[4,5]。
2．MYD88突变检测标本和方法：66例WM患者进行113例次MYD88突变检测，检测方法包括一代测序（Sanger法）、等位基因特异性聚合酶链反应（AS-PCR）和二代测序（NGS），标本来源包括淋巴结、骨髓和外周血。
3．外周血、骨髓和淋巴结肿瘤组织基因组DNA通过DNA纯化试剂盒提取并定量。外周血和骨髓未经CD19分选。留取标本均获得患者的知情同意并签署知情同意书。
4．NGS检测平台和深度：将基因组DNA片段化，构建DNA文库（200~250 bp）。用探针靶向捕获技术富集目的DNA片段，按照Illumina成对末端测序文库试剂盒说明书，使用150 bp成对末端reads构建上机文库。以定量试剂盒进行定量后，应用Illumina Novaseq平台对MYD88基因进行测序。肿瘤DNA样本的测序深度为1500~5000 ×。
5．统计学处理：采用SPSS 23.0软件进行统计学分析。组间率的比较采用似然比χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。
66例WM患者中，51例患者检测出MYD88突变阳性，MYD88突变阳性率为77%，包括50例MYD88L265P突变，1例MYD88L273P突变。其中39例患者初诊时进行不同方法和标本多次检测，因此MYD88突变检测共113例次。
113例次MYD88突变检测中，检测方法以NGS和AS-PCR为主，其中NGS方法49例次（43%），AS-PCR方法51例次（45%），Sanger法13例次（12%）。NGS方法检测MYD88突变阳性率为84%，AS-PCR方法阳性率为71%，而Sanger法阳性率为46%，NGS和AS-PCR检测MYD88突变阳性率均显著高于Sanger法（P值均<0.05）。
113例次的MYD88突变检测中，检测标本以淋巴结和骨髓为主，其中淋巴结标本47例次（41%），骨髓标本37例次（33%），外周血29例次（26%）。淋巴结标本MYD88突变检测阳性率为79%，骨髓阳性率为84%，外周血阳性率为52%，淋巴结和骨髓标本检测MYD88突变阳性率均显著高于外周血标本（P值均<0.05）。
49例采用NGS检测的WM患者中，淋巴结标本MYD88突变阳性率为86%（21例），骨髓MYD88突变阳性率为90%（19例），外周血MYD88突变阳性率为67%（9例），三种标本的差异无统计学意义（P值均>0.05）。51例采用AS-PCR检测的WM患者中，淋巴结标本MYD88突变阳性率为78%（18例），骨髓MYD88突变阳性率为81%（16例），外周血MYD88突变阳性率为53%（17例），骨髓MYD88突变阳性率显著高于外周血（P=0.040）。
66例WM患者中，39例患者进行了≥2次的MYD88突变检测（图1）。某一特定方法+标本组合检测MYD88突变准确次数（与图1第1行该例患者最终MYD88突变结果比较）/该组合总检测次数=该组合准确率。结果表明，NGS检测淋巴结（18例）和骨髓（13例）的准确率达100%，显著高于NGS检测外周血（4例）标本的准确率75%（P=0.030）。通过AS-PCR检测淋巴结的准确率为93%（15例），骨髓的准确率为91%（11例），外周血准确率为88%（16例），三者的差异无统计学意义（P>0.05）。在同一WM患者中比较不同检测组合检测MYD88突变的结果，更能直观反映不同组合的准确性和敏感性。例13通过NGS检测淋巴结显示MYD88突变阳性，而NGS检测外周血显示MYD88突变阴性；例22通过AS-PCR检测淋巴结显示MYD88突变阳性，而AS-PCR检测外周血显示MYD88突变阴性；例38通过Sanger法检测淋巴结显示MYD88突变阳性，而Sanger法检测外周血显示MYD88突变阴性；例39通过Sanger法检测骨髓显示MYD88突变阳性，而Sanger法检测外周血显示MYD88突变阴性。以上4例患者通过自身对照证实，无论使用何种检测方法，骨髓或淋巴结标本均优于外周血。例33通过NGS检测骨髓显示MYD88突变阳性，而AS-PCR检测骨髓显示MYD88突变阴性；例39通过NGS检测外周血显示MYD88突变阳性，而Sanger法检测外周血显示MYD88突变阴性。提示对于相同患者、相同标本，NGS方法可能更为敏感。此外，例13通过AS-PCR检测骨髓显示MYD88突变阳性，而NGS检测外周血显示MYD88突变阴性，提示尽管NGS敏感性高，仍不能克服外周血标本的假阴性。例19通过NGS检测骨髓显示MYD88突变阳性，而PCR检测淋巴结显示MYD88突变阴性，提示通过NGS检测骨髓标本可能是较优选择。
LN：淋巴结；BM：骨髓；PB：外周血；第一行为患者MYD88突变的最终结果（WM患者进行多次检测时，1次MYD88突变阳性即认为该患者阳性；若多次检测均阴性，则认为该例患者阴性）
基于MYD88突变在WM诊断、BTKi治疗及预后方面的重要价值，本中心对66例WM患者进行多种方法和多个标本的MYD88突变检测，总体MYD88突变阳性率为77%，其中1例患者为非MYD88L265P突变（MYD88L273P突变）。
Sanger法曾在MYD88突变检测中广泛应用，也能检测非L265P突变，但敏感性较低，不能发现<20%的突变细胞。如果DNA来源的标本未经富集，假阴性率可高达30%~50%[6]。Gachard等[7]报道，Sanger法检测未经分选骨髓的MYD88突变阳性率为67%。与此一致，本中心Sanger法总体阳性率仅46%，显著低于AS-PCR和NGS（P<0.05）。观察同一患者的系列结果，我们发现例37、例38和例39均出现Sanger假阴性结果，也再次证实Sanger法的不足。对于标本的选择，我们观察到淋巴结和骨髓优于外周血（P<0.05），应用Sanger法检测外周血标本时假阴性率更高（例38和例39）。敏感性较低的Sanger法比较适合CD19磁珠富集外周血，或在富集条件不允许的情况下采用淋巴结或骨髓标本，以尽可能降低检测的假阴性率。
针对L265P点突变的AS-PCR法敏感性较高，达1%[8]，且检测成本可控，缺点是只能检测L265P突变。国外报道显示，AS-PCR检测CD19分选骨髓的MYD88突变阳性率达到93%~97%[9,10]，而国内类似方法检测阳性率为73%~94%[11,12]。本中心AS-PCR方法检测MYD88突变阳性率为71%，可能与包含较多外周血标本（17例）有关。Xu等[13]报道，AS-PCR检测未分选外周血的阳性率为39.5%。与之类似，本中心AS-PCR检测外周血阳性率为53%，显著低于AS-PCR检测骨髓标本阳性率81%（P<0.05）。上述结果提示，即使AS-PCR敏感性较高，也无法克服外周血较高的假阴性率，而例22也补充证实AS-PCR检测外周血可能出现假阴性。
NGS的敏感性高，Nakamura等[14]报道其敏感性达0.02%，较AS-PCR高5倍。其次，NGS能检测非L265P突变并兼顾WM中40多种CXCR4突变类型[15]。NGS可以定量监测MYD88突变频率，而突变频率能间接反映WM的肿瘤负荷[16]。本中心NGS法检测MYD88突变阳性率最高，为84%。从标本选择来看，NGS检测骨髓阳性率最高，为90%，NGS检测外周血阳性率最低，为68%。分析结果表明，NGS检测骨髓或淋巴结的准确率均高于外周血（P<0.05），且例13也证实NGS检测外周血也可能出现假阴性。本中心WM患者整体MYD88突变阳性率为77%，低于国外文献报道，原因可能是25%的检测标本是未经CD19分选的外周血，12%的标本采用Sanger法检测。而根据本中心39例WM患者不同检测组合的MYD88突变结果，外周血和Sanger法均存在假阴性情况。
标本进行CD19富集能提高MYD88检测阳性率，特别是针对不敏感的Sanger法和肿瘤负荷较低的标本如外周血。对于骨髓标本是否一定需要CD19分选，仍有不同意见。WM患者初诊时通常有单克隆B细胞和单克隆浆细胞两群WM的重要组成细胞[17]，Gustine等[18]报道AS-PCR检测经治WM患者CD19分选后的骨髓标本，有6例患者MYD88突变阴性，而采用同样方法检测这6例患者未分选的骨髓标本却显示MYD88突变阳性。Gustine等[18]推测其原因可能是治疗减少了B细胞克隆，但残存的浆细胞克隆对CD19分选不敏感，造成假阴性，而未分选的骨髓标本不受影响。对于NGS是否一定最敏感，也存在争议。Kofides等[19]发现NGS检测WM患者骨髓MYD88突变的阳性率为66%，而同样的标本通过AS-PCR检测阳性率达96%，因此作者得出结论NGS不能敏感检测MYD88突变。我们发现此研究中尽管NGS方法平均测序深度为1 500 ×（范围305~3 707 ×），但敏感性仅5%，甚至低于AS-PCR方法。而本中心NGS方法测序深度较高，且测序前对标本目的片段行PCR扩增，因此NGS敏感性可达0.09%。更准确的结论有待未来行多中心、大样本研究证实。
本中心的初步研究提示，靶向NGS检测骨髓或淋巴结标本能敏感检出MYD88（包括L265P和非L265P）突变；若无法行NGS，推荐应用AS-PCR检测骨髓MYD88突变。检测标本方面，推荐初诊患者标本经CD19分选后行NGS/AS-PCR检测，尽量避免外周血标本；而对于CD20单抗治疗后的WM患者，未经分选的骨髓标本可能更佳。
目前WM患者疗效评价以IgM水平为标准[20]，但文献报道IgM水平和临床参数有不一致情况[3]。Xu等[13]报道，定量AS-PCR显示WM经治患者较初诊患者等位基因突变频率降低，ΔCt值升高，提示定量监测MYD88突变频率可能成为疗效判断的替代参数。此外，Wu等[21]采用定量AS-PCR检测WM患者外周血细胞游离DNA（cfDNA）的阳性率为85.2%，敏感性为0.4%，与AS-PCR检测骨髓标本一致性达96.3%。因此，外周血cfDNA检测MYD88突变敏感且创伤较小，值得推广。WM患者MYD88突变检测仍有较大的改善空间和临床应用前景，值得未来进一步探索。
所有作者声明无利益冲突
