探讨典型和不典型免疫表型慢性淋巴细胞白血病（CLL）在免疫表型、遗传学及分子生物学方面的差异及遗传学异常与基因突变的相关性。
依据英国马斯登皇家医院免疫分型积分系统对2014年11月至2021年5月期间南京医科大学第一附属医院收治的488例初诊CLL患者进行分类，其中积分4～5分为典型免疫表型CLL（tCLL）（382例），积分3分为不典型免疫表型CLL（aCLL）（106例）。采用多参数流式细胞术对所有CLL患者外周血标本进行免疫表型检测，荧光原位杂交（FISH）技术检测359例CLL患者的遗传学异常，二代测序（NGS）技术检测330例CLL患者基因突变情况。
aCLL患者CD10、CD22、CD49d、CD81和FMC7阳性表达率显著高于tCLL患者（P值分别为0.020、<0.001、<0.001、0.027和<0.001），CD5、CD23、CD148和CD200的阳性表达率显著低于tCLL患者（P值分别为<0.001、0.017、0.041和<0.001）。aCLL患者+12阳性率显著高于tCLL患者（P<0.001），del（13q14）阳性率显著低于tCLL患者（P<0.001），同时aCLL患者NOTCH1突变发生率高于tCLL患者（P＝0.038），其余基因突变发生率在两组间的差异均无统计学意义（P值均>0.05）。生存分析显示，tCLL和aCLL患者总生存（OS）率与无治疗生存（TFS）率的差异无统计学意义（P值均>0.05）。
tCLL与aCLL患者的抗原表达特征、细胞遗传学及体细胞突变均存在差异，有助于tCLL与aCLL的诊断和鉴别诊断。
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慢性淋巴细胞白血病（chronic lymphocytic leukemia，CLL）是一种淋巴细胞克隆性增殖的恶性血液病，具有典型的形态学和免疫学表型特征。但随着对CLL研究的深入，发现CLL在疾病诊断、发病形式、治疗反应及预后等方面有很大异质性。NCCN指南提出，典型的CLL免疫表型为CD19+CD5+CD23+CD10-CD20dimslgdim，但也存在小部分以slgbright或CD23-/dim或CD20bright为特征的不典型免疫表型。越来越多的学者对具有不典型免疫表型的CLL进行研究。有研究根据Moreau Score（MS）积分系统，将积分<4或CD23-定义为不典型免疫表型CLL（atypical chronic lymphocytic leukemia，aCLL）[1]。与典型免疫表型CLL（typical chronic lymphocytic leukemia，tCLL）相比，aCLL患者WBC和淋巴细胞绝对计数更高，而PLT较低[2]。推测tCLL和aCLL的发生发展和转归可能存在异质性。近年来，随着二代测序（next generation sequencing, NGS）技术逐渐应用于临床，发现了参与CLL发生发展的众多基因突变，涉及NOTCH信号通路、B细胞受体信号通路、细胞凋亡、表观遗传学调控、炎症因子通路、DNA损伤修复与细胞周期调控、RNA代谢等。目前研究多集中于aCLL与tCLL在形态学、免疫表型及遗传学等方面的研究，而分子生物学相关研究尚无报道。本研究回顾性分析488例CLL患者的免疫表型特征，探索aCLL和tCLL细胞遗传学和基因突变的差异、相关性及患者预后的差异。
收集2014年11月至2021年5月南京医科大学第一附属医院（江苏省人民医院）血液科收治的488例初诊CLL患者的临床资料。根据英国马斯登皇家医院（RMH）免疫标志积分系统，积分4～5分为tCLL（382例），积分3分为aCLL（106例）。男330例（67.6%），女158例（32.4%），中位年龄61（22～88）岁，所有患者均符合CLL诊断标准[3]。积分3分病例常规采用荧光原位杂交（FISH）检测t（11;14），免疫组织化学（IHC）检测CyclinD1、SOX11，均为阴性后排除套细胞淋巴瘤（mantle cell lymphoma, MCL）；通过组织病理学和FISH检测t（14;18）排除滤泡淋巴瘤（follicular lymphoma, FL）。一些具有不典型形态的淋巴浆细胞性淋巴瘤（lymphoplasmacytic lymphoma, LPL）多为CD23-，结合MYD88 L265P的突变位点等特征进行综合判断并排除。极少数CD5+边缘区B细胞淋巴瘤（marginal zone B-cell lymphoma, MZL）通常表现为CD23-CD200-，结合临床和组织病理学特点排除。根据形态学特点和诊断标准排除CD5+幼稚淋巴细胞白血病（prolymphocytic leukemia, PLL）。
应用多参数FCM分析CLL细胞表面不同抗原的表达情况（美国Beckman Navios流式细胞仪）。应用的单克隆靶向抗体包括：CD5（ECD）、CD10（PE）、CD19（A750）、CD148（PE）、CD20（PC7）、CD22（PB）、CD200（APC）、CD79b（PC5.5）、CD23（APC）、IgM（PB）、CD45（KO）、CD49d（PE）、FMC7（FITC）、CD35（FITC）、CD38（ECD）、CD25（PC5.5）、CD11c（PC7）、CD103（APC）、CD81（FITC）、CD160（PE）、CD19（PC5.5）、Kappa（FITC）、Lambda（PE）（美国Beckman公司）。具体检测步骤参照文献[4]，应用Kaluza软件分析免疫表型特点，抗原表达率以≥20%为阳性。
共485例CLL进行染色体核型分析；共359例CLL采用GLP D13S319、LSI TP53探针、LSI MBY探针、LSI ATM DNA探针、CEP +12 DNA探针、LSI IGH探针（美国Vysis公司），运用I-FISH技术分别检测del（13q14）、del（17p13）、del（6q23）、del（11q23）、+12和IGH重排，于Olympus BX60荧光显微镜下观察间期细胞荧光杂交信号，具体步骤详见说明书。以上细胞遗传学异常分别以大于10%、5%、8%、8%、5%、8%为阳性标准。
采用IGVH基因引物和IGH体细胞超突变凝胶检测分析试剂盒（InVivoScribe公司）检测IGVH基因突变，具体参照文献[5]。应用IMGT/V-QUEST数据库对测序结果进行比对分析，以VH碱基突变率≥2%作为体细胞突变标准。
收集患者初诊时骨髓单个核细胞1.0×107，采用DNA提取试剂盒（北京TIANGEN公司）提取基因组DNA，以至少100 ng DNA进行扩增建库，应用Illumina MiSeq测序仪对40个基因外显子热点区域测序，平均测序深度1000×，使用TMAP（torrent mapping alignment program）软件分析测序结果。检测基因包括：ARID1A、ATP6AP1、ATP6V1B2、ATM、BIRC3、BRAF、BTK、BCL2、CARD11、CDKN1B、CHD2、CXCR4、CCND1、CREBBP、EGR2、EP300、EZH2、FOXO1、FAT1、FBXW7、IGLL5、KMT2D、KLF2、KRAS、MAP2K1、MYD88、NFKBIE、NOTCH1、NOTCH2、TP53、PLCG2、PTPRD、POT1、RPS15、RRAGC、SAMHD1、SF3B1、TET2、TNFRSF14、XPO1。
采用SPSS 19.0进行数据分析，计数资料用例数（百分比）描述，计量资料用M（范围）描述。计量资料的比较采用t检验，率的比较采用χ2检验，总生存（OS）率与无治疗生存（TFS）率采用Kaplan-Meier法进行生存分析，采用Log-rank检验进行生存率比较，所有统计学分析采用双侧检验，P<0.05为差异有统计学意义。
488例CLL患者中，aCLL 106例（21.7%），tCLL 382例（78.3%）。aCLL患者的中位年龄为65（33～88）岁，tCLL患者的中位年龄为59（22～86）岁。与aCLL患者相比，tCLL患者男性比例较高（P＝0.023），≥60岁比例较低（P＝0.047），HGB较高（P＝0.031）。两组患者WBC、淋巴细胞绝对计数、PLT、β2-微球蛋白（β2-MG）、LDH及Binet分期等的差异均无统计学意义（P值均>0.05）（表1）。
aCLL与tCLL患者的临床特征比较
aCLL与tCLL患者的临床特征比较
| 临床特征 | aCLL（106例） | tCLL（382例） | χ2值/t值 | P值 | |
|---|---|---|---|---|---|
| 性别[例（%）] | 5.158 | 0.023 | |||
| 男 | 62（58.5） | 268（70.2） | |||
| 女 | 44（41.5） | 114（29.8） | |||
| 年龄[例（%）] | 3.949 | 0.047 | |||
| <60岁 | 42（39.6） | 193（50.5） | |||
| ≥60岁 | 64（60.4） | 189（49.5） | |||
| WBC[×109/L，M（范围）] | 23.8（3.3～690.9） | 23.3（1.0～540.4） | 0.846 | 0.398 | |
| ALC[×109/L，M（范围）] | 19.1（0.2～594.9） | 18.4（0.6～392.4） | 0.829 | 0.408 | |
| HGB[g/L，M（范围）] | 116.0（45.0～182.0） | 123.0（36.0～170.0） | -2.159 | 0.031 | |
| PLT[×109/L，M（范围）] | 121.0（9.0～451.0） | 131.0（2.0～365.0） | -0.225 | 0.822 | |
| β2-微球蛋白[mg/L，M（范围）] | 3.6（1.0～19.0） | 3.4（1.3～15.8） | 1.203 | 0.230 | |
| LDH[mg/L，M（范围）] | 216.0（114.0～1574.0） | 212.0（110.0～1092.0） | 1.401 | 0.162 | |
| Binet分期[例（%）] | 2.581 | 0.275 | |||
| A期 | 30（31.6） | 108（29.4） | |||
| B期 | 23（24.2） | 120（32.6） | |||
| C期 | 42（44.2） | 140（38.0） | |||
| 治疗方案[例（%）] | 1.307 | 0.520 | |||
| 传统免疫化疗a | 25（52.1） | 94（43.7） | |||
| 新药单药b | 7（14.6） | 43（20.0） | |||
| 联合用药c | 16（33.3） | 78（36.3） | |||
注：aCLL：不典型免疫表型慢性淋巴细胞白血病；tCLL：典型免疫表型慢性淋巴细胞白血病；ALC：淋巴细胞绝对计数；LDH：乳酸脱氢酶；a以嘌呤类似物或苯丁酸氮芥为基础的化学免疫治疗等；b BTK抑制剂或Bcl-2抑制剂等；c以嘌呤类似物或苯丁酸氮芥为基础的化学免疫治疗联合BTK抑制剂或Bcl-2抑制剂
488例aCLL和tCLL患者进行了23个抗原表达分析，aCLL患者CD10、CD22、CD49d、CD81和FMC7的阳性表达率显著高于tCLL患者（P值分别为0.020、<0.001、<0.001、0.027和<0.001），而aCLL患者CD5、CD23、CD148和CD200的阳性表达率显著低于tCLL（P值分别为<0.001、0.017、0.041和<0.001）（图1）。
aCLL：不典型免疫表型慢性淋巴细胞白血病；tCLL：典型免疫表型慢性淋巴细胞白血病；与aCLL相比，a P<0.001，b P<0.05
359例患者进行FISH检测，aCLL中+12及IGH重排阳性率显著高于tCLL组（P<0.001和P＝0.002），而aCLL中del（13q14）阳性率显著低于tCLL组（P<0.001）。两组del（17p13）、del（11q23）及del（6q23）的阳性表达率差异均无统计学意义（P>0.05）。485例患者进行染色体核型分析，22例aCLL（20.8%）和89例tCLL（23.5%）存在复杂核型（CP）异常（P>0.05）（表2）。
aCLL与tCLL患者分子遗传学特征比较[例（%）]
aCLL与tCLL患者分子遗传学特征比较[例（%）]
| 组别 | del(17p13)阳性 | del(11q23)阳性 | del(13q14)阳性 | +12阳性 | del(6q23)阳性 | IGH重排阳性 | 复杂核型 | IGHV突变 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| aCLL | 5（7.1） | 8（11.4） | 15（21.4） | 25（35.7） | 5（7.1） | 18（25.7） | 22（20.8） | 41（50.6） |
| tCLL | 38（13.1） | 57（19.7） | 149（51.6） | 35（12.1） | 10（3.5） | 32（11.1） | 89（23.5） | 154（49.4） |
| χ2值 | 1.882 | 2.615 | 20.614 | 22.554 | 1.890 | 9.746 | 0.349 | 0.041 |
| P值 | 0.218 | 0.106 | <0.001 | <0.001 | 0.184 | 0.002 | 0.554 | 0.840 |
注：aCLL：不典型免疫表型慢性淋巴细胞白血病；tCLL：典型免疫表型慢性淋巴细胞白血病
81例aCLL患者和312例tCLL患者检测IGHV突变，两组突变率的差异无统计学意义（P＝0.840）。采用NGS对330例初诊CLL患者（aCLL 78例，tCLL 252例）进行40个基因外显子热点区域测序。aCLL基因突变率为53.8%（42/78），其中5.1%（4/78）携带三个及以上基因突变，突变频率最高的基因依次为NOTCH1（15.4%）、SF3B1（10.3%）和IGLL5（7.7%）（图2）。tCLL基因突变率为62.7%（158/252），其中8.7%（22/252）携带三个及以上基因突变，突变频率最高的基因依次为ATM（11.1%）、TP53（9.5%）和NOTCH1（7.5%）（图2）。aCLL组的NOTCH1突变率显著高于tCLL组（P＝0.038），两组间其余基因突变率的差异均无统计学意义（P值均>0.05）。进一步选取突变发生率最高的6个基因，分析其基因突变与遗传学异常及IGHV突变状态是否存在关联。结果显示，aCLL中，SF3B1和NOTCH1突变与IGHV无突变型相关（P值分别为0.027和0.008）（图3A）。tCLL中，TP53突变和NOTCH1突变与IGHV无突变型相关（P值分别为0.017和<0.001）（图3B）。aCLL和tCLL患者IGLL5突变均与IGHV突变型相关（P值分别为0.018和<0.001），两组患者中TP53突变在del（17p13）异常的患者中更为常见（图3）。在aCLL中，SF3B1突变与NOTCH1突变相关（P＝0.017）（图3A）。
所有基因仅列出一级变异。aCLL：不典型免疫表型慢性淋巴细胞白血病；tCLL：典型免疫表型慢性淋巴细胞白血病；与aCLL相比，a P＝0.038
黑色表示阳性或突变，白色表示阴性或无突变，横坐标表示纳入统计的例数。aCLL：不典型免疫表型慢性淋巴细胞白血病；tCLL：典型免疫表型慢性淋巴细胞白血病
随访时间截至2021年7月1日，79例aCLL随访患者中，有48例（60.8%）患者因出现治疗指征（参照国际CLL工作组指南判定）而接受治疗，其中15例患者诊断时即满足治疗指征，33例在观察等待过程中出现治疗指征，另外31例（39.2%）患者随访期内未接受治疗，8例因感染或疾病进展等死亡。整组患者的中位无治疗生存（TFS）时间为38.0（95%CI 31.8～44.2）个月，中位OS时间为54.0（95%CI 46.0～62.0）个月。337例tCLL随访患者中，有215例（63.8%）患者因出现治疗指征（参照国际CLL工作组指南判定）接受治疗，其中62例患者诊断时即满足治疗指征，153例患者在观察等待过程中出现治疗指征，另外122例（36.2%）患者随访期内未接受治疗，28例因感染或疾病进展等死亡。整组患者的中位TFS时间为58.9（95%CI 38.8～79.0）个月，中位OS时间为73.9（95%CI 49.2～98.6）个月。根据治疗方案进一步将aCLL和tCLL分别分为传统免疫化疗组、新药单药组、联合用药组，对其进行生存分析，差异均无统计学意义（P值均>0.05）。在传统免疫化疗组中，aCLL患者的中位OS时间为52.5（95%CI 45.9～59.1）个月，低于tCLL患者的中位OS时间59.0（95%CI 58.0～60.0）个月，差异无统计学意义（P＝0.059）。
既往CLL诊断主要依赖细胞形态学，FAB组织基于形态学特征将CLL分成三种亚型：经典型、幼稚淋巴细胞白血病（外周血涂片中有10%～55%幼稚淋巴细胞）及不典型形态的CLL（特征是细胞形态比经典型更大，细胞质更丰富或带有裂隙的淋巴细胞）。资料显示，具有不典型形态学的CLL发生率为10.0%～36.0%[6]，本中心aCLL占21.7%。随着多参数FCM应用于CLL的诊断，如今主要通过免疫表型特征分析诊断CLL。本组病例结果显示，aCLL中最常见的表型特征为CD5、CD23阴性及FMC7阳性，与文献[7,8]报道一致。Ting等[9]发现，aCLL中CD200阳性表达率显著高于MCL，本研究显示aCLL中CD200和CD148的阳性表达率显著低于tCLL，同时发现CD10、CD22、CD49d和CD81阳性表达率显著高于tCLL，因此这些免疫标记可以对两者进行鉴别诊断。虽然有学者认为在aCLL中CD38高表达[10]，但本研究中两组患者CD38阳性表达率的差异无统计学意义。
CLL常伴随的del（17p）、del（11q）、del（13q）、+12等细胞遗传学异常参与了疾病的发生、发展。文献报道，与tCLL相比，aCLL+12异常比例更高[6,10]，而tCLL仅伴del（13q）异常的患者比例明显高于aCLL[11]。本研究发现，aCLL中有25例（35.7%）患者存在+12异常，显著高于tCLL（P<0.001），del（13q）异常发生率显著低于tCLL（P<0.001）。有学者发现，+12与较差的预后相关，del（13q）异常多存在于tCLL且与良好预后相关[10]。
近年来，高通量测序技术的发展极大地促进了CLL分子异常的研究，NOTCH1和SF3B1被认为是最常发生于CLL的分子突变。本研究中突变频率最高的基因是ATM，占10.0%，其次是NOTCH1（9.4%）和TP53（8.2%），与文献报道的初诊CLL中ATM、NOTCH1、TP53的突变率10.0%～20.0%、4.7%～12.3%、4.0%～10.0%一致[12,13,14]。NOTCH1基因位于9号染色体长臂，NOTCH1突变导致其蛋白高表达，进而促进NOTCH1信号通路激活，参与了CLL细胞的生存、抗凋亡及耐药。有学者认为CLL细胞NOTCH1表达水平较其他类型淋巴瘤高，将NOTCH1突变纳入CLL预后不良的重要指标之一，且与Richter转化存在密切联系[15,16,17]。本研究发现，aCLL中NOTCH1突变发生率较tCLL更高，差异有统计学意义（P＝0.038），且NOTCH1突变与IGHV无突变型存在明显相关性。本研究提示，在aCLL或tCLL中，IGLL5突变常与IGHV突变同时发生，与Kasar等[18]得出的结论类似，此外，IGLL5突变是低风险CLL患者的独特分子特征。
综上所述，既往aCLL与tCLL的差异研究主要局限于形态学、免疫表型以及遗传学，尚无两者分子学异常差异的研究报道。我们结合NGS比较了两组患者基因突变的差异，进而探索了遗传学异常和基因突变的相关性。本研究发现，与tCLL相比，aCLL常伴随CD49d阳性、+12异常、NOTCH1突变，较少出现del（13q），这些特征不仅有助于aCLL和tCLL的鉴别诊断，同时也有助于对两者的生物学特征进行深入挖掘。我们根据用药情况对两组患者的OS时间和TFS时间进行分析，发现aCLL和tCLL的差异无统计学意义（P值均>0.05）。Criel等[19]的研究发现，与tCLL相比，aCLL的OS时间更短，预后更差，分析其原因可能如下：地域人群和分类方式等不同造成生存差异，本研究通过免疫表型将CLL分为aCLL和tCLL，而Criel等[19]通过形态学分类；由于新药时代来临，临床广泛使用包括BTK抑制剂、BCL-2抑制剂等靶向药物，极大地改善了CLL患者的生存率导致两者差异减小；本研究观察的时间较短。在后续研究中，我们将进一步扩大样本量并进行长期随访，深入研究aCLL和tCLL在预后方面的差异。
所有作者声明无利益冲突
