探究新型Ⅰ类和Ⅱb类选择性组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂甲磺酸普依司他（PM）对弥漫大B细胞淋巴瘤的体外抑制活性及作用机制。
MTT法检测PM对细胞增殖的影响，流式细胞术检测PM对细胞周期、细胞凋亡的影响，Western blot法检测HDAC底物乙酰化水平、细胞周期蛋白、凋亡相关蛋白和癌基因蛋白的表达。
PM对淋巴瘤细胞株SUDHL-4和SUDHL-6的增殖具有明显抑制作用，能够上调HDAC底物H3、H4和α-tubulin乙酰化水平。在细胞周期实验中，PM可诱导SUDHL-4、SUDHL-6细胞G0/G1期阻滞，Western blot显示PM能显著下调细胞周期蛋白依赖性激酶Cdk2、Cdk4、Cdk6及细胞周期蛋白Cyclin D1、Cyclin E的表达，上调CDK抑制蛋白p21的表达。在细胞凋亡实验中，PM可诱导SUDHL-4和SUDHL-6细胞凋亡，Western blot显示PM通过激活Caspase3激酶和影响抗凋亡蛋白Bcl-2促进细胞内源性凋亡。此外，PM也能够下调癌基因标志蛋白MYC、IKZF1、IKZF3的表达。
PM在体外对弥漫大B细胞淋巴瘤包括双打击淋巴瘤具有高效的生物活性，为PM应用于临床治疗提供了有价值的实验依据。
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弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）是最常见的淋巴瘤亚型，我国每年约3万新发病例，占所有淋巴瘤的30%~40%[1,2]。在利妥昔单抗时代，一线免疫化疗后仍有40%~50%的患者治疗后出现疾病难治或复发[3]，复发或难治患者预后较差，通过挽救性化疗或自体造血干细胞移植治疗，仅10%的患者能最终治愈[4,5,6,7,8,9]。其中部分病例涉及MYC、BCL2和（或）BCL6基因重排，被称为双打击淋巴瘤（DHL）或三打击淋巴瘤（THL）。DHL在DLBCL中所占比例虽不超过12%[10]，但侵袭性强，常规化疗预后极差，目前尚无标准治疗方案。因此，DLBCL包括DHL在治疗方面仍存在未满足的需求，迫切需要开发新型靶向药物和创新性疗法。
组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）是表观遗传学领域用于肿瘤临床研究最成功的一类靶点，共分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四类，研究表明，在血液系统肿瘤中常发生HDAC Ⅰ类和Ⅱ类酶的过表达或失调[11]。靶向抑制HDAC的活性可抑制肿瘤细胞增殖分化、抑制肿瘤迁移或促进肿瘤细胞凋亡等[12]。目前全球已有5个HDAC抑制剂获批上市[13,14]，其中4个适应证均为复发难治性外周T细胞淋巴瘤，1个获批用于复发难治性多发性骨髓瘤的联合治疗，多数为非选择型的HDAC泛抑制剂，常见的脱靶效应导致药物不良反应较多。新型Ⅰ类和Ⅱb类选择性HDAC抑制剂甲磺酸普依司他（purinostat mesylate，PM）2018年11月获国家药品监督管理局批准，目前正在四川大学华西医院开展Ⅰ期临床试验（CXHL1800174），获批的适应证为复发或难治的以B细胞相关肿瘤为主的血液系统肿瘤。为探讨PM在DLBCL包括DHL中的潜在临床应用价值，我们进行了如下初步研究。
PM由四川大学生物治疗国家重点实验室提供，批号PMF20170901；纯度：98.67%；含量95.80%。帕比司他（LBH589）购自大连美仑公司。一抗Ac-α-tublin购自美国Santa Cruz Biotechnology公司，Bcl-2购自美国Sigma-Aldrich公司，c-Myc、IKZF1购自英国Abcam公司，Ac-H3、Ac-H4、Cleaved caspase3、PARP-1、IKZF3购自成都正能生物技术有限责任公司，p21、Cdk2、Cdk4、Cdk6、CyclinD1、CyclinE购自美国Cell Signaling Technology公司。GAPDH、鼠抗人β-actin单克隆抗体，HRP标记羊抗兔和羊抗鼠二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司。膜联蛋白V（Annexin V）/碘化丙锭（PI）双染试剂盒、PI及RNase均购自大连美仑公司。
人DLBCL细胞株SUDHL-4、SUDHL-6（DHL亚型）来自美国典型培养物保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC），由四川大学生物治疗国家重点实验室细胞库培养保种。细胞培养于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 mg/L链霉素的RPMI 1640培养液中，在37 ℃、5%CO2、饱和湿度的恒温培养箱中培养，定期传代，取对数生长期细胞用于实验。
选用对数生长期的肿瘤细胞，将细胞按（1~2）×104个/100 μl接种于96孔板中，按浓度梯度加入PM或LBH589（1 000、200、40、8、1.6、0.32、0.064 nmol/L），对照孔加入等体积稀释相同比例的DMSO溶液，置于37 ℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养至72 h，每孔加入20 μl的MTT溶液，在培养箱孵育4 h后每孔加入MTT溶解液100 μl，次日用酶标仪测定570 nm处的吸光值，采用Graphpad prism 5.0软件计算细胞增殖抑制率，拟合半抑制浓度（IC50）值。
收集不同浓度PM（0.25、0.5、1 nmol/L）处理24 h后的细胞悬液，500×g离心3 min，PBS洗涤细胞2次，70%冰乙醇固定，加PI染液避光染色约10 min后进行流式细胞术检测，流式细胞术结果采用ModFit软件进行细胞群体各周期比例分析。
收集不同浓度药物处理48 h后的细胞悬液，500×g离心3 min，PBS洗涤细胞2次。加结合缓冲液（binding buffer）重悬细胞后，每个流式管中加入5 µl体积的Annexin Ⅴ染液，室温下避光染色10 min，再加入5 µl的PI染料染色，避光放置，1 h内上流式细胞仪检测。
分别收集药物处理组及未处理组细胞，加入细胞裂解液混匀后冰上裂解30 min，离心收集上清，BCA法检测蛋白浓度，然后进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后转膜至PVDF膜，50 g/L脱脂牛奶室温封闭2 h，一抗4 ℃孵育过夜，次日洗涤后加入相应二抗共孵育1 h，洗涤后进行X光胶片显影，采用Image J分析软件进行灰度扫描。
采用Graphpad Prism 6.0软件进行数据分析，多组数据间比较采用单因素方差分析（ANOVA），采用tukey的多组比对分析法进一步分析特定两组之间差异的显著性。两组数据间比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义，实验数据以平均值±标准差表示。
PM对DLBCL细胞株SUDHL-4和SUDHL-6（DHL亚型）具有明显抑制作用，与同类药物LBH589相比，其IC50值分别为（0.333±0.279）nmol/L对（3.431±0.588）nmol/L和（0.557±0.195）nmol/L对（4.005±0.372）nmol/L（实验重复3次）。进一步对SUDHL-4、SUDHL-6进行化合物的细胞毒活性分析，测定药物作用72 h后发挥细胞毒活性的半数致死量（LD50）值，结果显示，与LBH589相比，PM对SUDHL-4、SUDHL-6细胞株具有明显细胞毒性，其LD50值分别为（2.733±0.561）nmol/L对（17.140±0.580）nmol/L和（1.278±0.198）nmol/L对（9.718±0.540）nmol/L（实验重复3次）。
组蛋白H3、H4作为HDAC Ⅰ类酶的底物，其乙酰化状态（Ac-H3、Ac-H4）可用来衡量HDAC Ⅰ类酶活性；微管蛋白α-tubulin是HDAC6的特异性底物，其乙酰化的状态（Ac-α-tubulin）常用来衡量HDAC Ⅱb类酶活性。在SUDHL-4和SUDHL-6细胞中加入设定浓度的PM处理6 h后收集细胞提取蛋白，Western blot法检测标志性蛋白Ac-H3、Ac-H4和Ac-α-tubulin的表达情况。结果显示，对于SUDHL-4细胞，0.3~1 nmol/L浓度的PM就可明显诱导组蛋白H3或H4乙酰化水平升高，30~100 nmol/L浓度可明显诱导α-tubulin乙酰化水平升高（图1）。在SUDHL-6细胞中也得到类似的结果，0.3~1 nmol/L浓度的PM可明显诱导组蛋白H3或H4乙酰化水平升高，3~10 nmol/L浓度可明显诱导α-tubulin乙酰化水平升高（图2）。细胞实验结果显示了PM对HDAC Ⅰ类和Ⅱb类的高抑制活性，与同类上市药物LBH589比较，PM对HDAC Ⅰ类的抑制活性明显优于LBH589。
PM：甲磺酸普依司他；LBH589：帕比司他
PM：甲磺酸普依司他；LBH589：帕比司他
不同浓度（0.25、0.5、1 nmol/L）的PM处理SUDHL-4、SUDHL-6细胞24 h，70%乙醇固定后行PI染色，流式细胞仪进行细胞周期分析。结果显示，PM可诱导SUDHL-4、SUDHL-6细胞G0/G1期阻滞，且呈剂量依赖性（图3）。0.5 nmol/L的PM能显著诱导SUDHL-4和SUDHL-6细胞G0/G1期阻滞，G0/G1期细胞所占比例分别为64.89%、74.04%，而溶剂对照组G0/G1期细胞所占比例分别为46.92%、54.81%。
PM：甲磺酸普依司他
通过Western blot研究G0/G1期相关细胞周期蛋白及细胞周期蛋白依赖性激酶（CDKs）抑制剂p21的表达。结果显示，PM能显著下调细胞周期蛋白依赖性激酶Cdk2、Cdk4、Cdk6及细胞周期蛋白Cyclin D1、Cyclin E的表达，浓度依赖地上调CDK抑制蛋白p21的表达（图4）。
用不同浓度（0.3、3、30 nmol/L）的PM处理SUDHL-4、SUDHL-6细胞48 h后，流式细胞术分析细胞凋亡情况。结果显示，30 nmol/L的PM能明显引起SUDHL-4、SUDHL-6细胞凋亡，凋亡细胞所占比例分别为93.40%、93.60%；溶剂对照组凋亡细胞所占比例分别为5.73%、2.06%，远低于药物作用组（图5）。
PM按照设定浓度处理SUDHL-4和SUDHL-6细胞48 h，Western blot法检测其凋亡蛋白的表达情况。结果显示，PM处理SUDHL-4和SUDHL-6细胞48 h后，Cleaved-Caspase3和PARP-1表达上调，说明PM激活了Caspase3激酶。此外抗凋亡蛋白Bcl-2表达下调，表明PM能诱导SUDHL-4和SUDHL-6细胞发生内源性凋亡（图6）。
以设定浓度的PM处理SUDHL-4和SUDHL-6细胞24 h后，收集细胞提取蛋白，Western blot法检测癌基因标志性蛋白MYC、IKZF1和IKZF3的表达情况。结果显示，PM能够浓度依赖性地下调SUDHL-4和SUDHL-6细胞MYC、IKZF1、IKZF3的表达（图7）。
近年来，HDAC在肿瘤中的作用受到广泛关注，HDAC的功能为催化组蛋白及部分非组蛋白赖氨酸残基的去乙酰化，在细胞内的表观遗传和转录后修饰中发挥重要作用[15,16]。研究发现，在肿瘤细胞中常发生HDAC高表达，导致表观遗传失控和胞质内重要功能蛋白失调[11]。HDAC抑制剂能够通过恢复组蛋白的乙酰化水平激活抑癌基因，并通过诱导多种胞质蛋白乙酰化抑制肿瘤细胞增殖，促使肿瘤细胞凋亡[12]。研究表明，HDAC中Ⅰ类和Ⅱ类与肿瘤关系密切，Ⅱ类又分为Ⅱa和Ⅱb，其中Ⅱa类和Ⅳ类酶与细胞运动、细胞能量代谢、机体免疫调节等功能密切相关[17]。目前全球已有5个HDAC抑制剂获批上市[13,14]，中国仅有1个HDAC抑制剂获批上市，其中3款为HDAC泛抑制剂，因存在对Ⅱa和Ⅳ类酶的抑制而导致药物不良反应较多，LBH589可能引起严重心脏毒性和严重腹泻。设计合成HDAC Ⅰ类和Ⅱb类高选择性抑制剂可以降低HDAC抑制剂治疗肿瘤的不良反应。PM是高选择性Ⅰ类和Ⅱb类HDAC抑制剂，且酶抑制活性优于LBH589，可避免对Ⅱa和Ⅳ亚型抑制引起的毒性。
DLBCL是最常见的B细胞淋巴瘤亚型，我国每年新增淋巴瘤患者约10万人，其中DLBCL约占三分之一[1,2]。在利妥昔单抗时代，常规免疫化疗后40%~50%的患者出现难治或复发[3]。复发或难治性患者预后较差，通过传统挽救性化疗或自体造血干细胞移植治疗后，仅约10%患者能最终治愈[4,5,6,7,8,9]。复发或难治性DLBCL常为特殊亚型或存在预后不良因素，其中部分病例涉及由于MYC、BCL2和（或）BCL6基因重排导致的MYC、BCL2和（或）BCL6过表达，这类亚型被2017年WHO淋巴瘤第4版修订版分类正式命名为高级别B细胞淋巴瘤伴MYC、BCL2和（或）BCL6重排[18]，俗称DHL或THL，该类型淋巴瘤中癌基因MYC、BCL和（或）BCL6高度活化，侵袭性高，生存率低，目前尚无标准治疗方案，尽管进行强化联合化疗（RTX+Hyper-CVAD、RTX+DA-EPOCH等）甚至自体造血干细胞移植，中位总生存期仅1~2年[19,20,21]。因此，DLBCL包括DHL在治疗方面仍存在未满足的需求，迫切需要开发新型靶向药物和创新性疗法以提高疾病治愈率，改善疾病治疗现状。
我们的体外实验表明，PM对DLBCL包括DHL细胞系具有很强的抗增殖活性和细胞毒性，并优于同类药物LBH589。PM能够上调DLBCL和DHL细胞系组蛋白H3、H4和α-tubulin的乙酰化水平，诱导发生G0/G1期周期阻滞从而抑制淋巴瘤细胞增殖，以浓度依赖的方式诱导淋巴瘤细胞凋亡。Western blot显示PM可能通过影响CDK-Cyclin复合物活性诱导细胞G0/G1期阻滞，并通过激活Caspase3激酶和影响抗凋亡蛋白Bcl-2促进细胞内源性凋亡。
MYC蛋白过表达会导致细胞过度增殖、凋亡抑制、代谢重组等促肿瘤效应[22]。最常观察到的导致MYC蛋白过表达的原因为MYC基因重排，在DHL和少数DLBCL病例中，MYC重排是一个决定性特征，此外，MYC基因扩增在2%~20%的DLBCL病例中被观察到[23,24]。因此，MYC可作为DLBCL和DHL治疗的潜在靶点。IKZF1和IKZF3属于Ikaros转录因子家族，是参与B细胞分化的转录因子，在针对肿瘤的研究中发现，敲除B细胞淋巴瘤的IKZF1和IKZF3能抑制肿瘤细胞生长，说明B细胞淋巴瘤的发生发展可能与IKZF1/3的失调有关[25,26]。因此，通过干预IKZF1、IKZF3或MYC可能具有治疗B细胞淋巴瘤的潜力。我们的研究结果表明，PM能够浓度依赖性地下调DLBCL和DHL细胞系MYC、IKZF1、IKZF3的表达。
综上所述，本研究结果表明PM在体外对DLBCL包括DHL均具有高效的生物活性，具有治疗DLBCL包括DHL的潜力，为PM应用于临床治疗提供了有价值的实验依据。
所有作者声明不存在利益冲突
