建立兔下颌骨种植体植入模型，对含Zn活性涂层种植体骨结合界面进行评价。
将商业纯钛加工成柱状种植体，通过微弧氧化（MAO）法制备活性涂层，根据是否加入Zn元素分为MAO-Ca/P和MAO-Zn/Ca/P涂层种植体。将2种种植体随机植入兔下颌骨，对照组植入MAO-Ca/P涂层种植体，实验组植入MAO-Zn/Ca/P涂层种植体。分别于术后4周和12周取材，组织学分析2组种植体与骨结合界面情况，比较骨质覆盖率。
MAO层呈微孔状结构，致密均匀，孔径随Zn元素的加入而变大。种植体骨结合界面组织形态学观察结果显示，随着时间的延长，种植体表面附着的骨质增多，术后4周和12周实验组的骨组织附着量均高于对照组，且排列更紧密。术后12周实验组的骨质覆盖率（（70.8±13.6）%）显著高于对照组（（55.9±13.8）%），差异具有统计学意义（P<0.05）。骨结合界面元素线扫描结果显示，术后12周实验组有生物类骨磷灰石形成。
Zn元素的加入能提高涂层的生物学活性，增强涂层的成骨能力，促进种植体与骨组织界面的结合。
版权归中华医学会所有。
未经授权，不得转载、摘编本刊文章，不得使用本刊的版式设计。
除非特别声明，本刊刊出的所有文章不代表中华医学会和本刊编委会的观点。
在骨结合理论的指导下，口腔种植学得到了突飞猛进的发展。种植体的即刻或早期负重是种植技术的发展趋势，快速、紧密的骨结合是种植体即刻或早期负重的基本要求，而材料学的发展及种植体表面处理技术的不断改进为种植体即刻或早期负重提供了可能[1]。特别是近年来兴起的微弧氧化（micro-arc oxidation, MAO）技术，其在钛表面原位生成陶瓷膜层，结合强度高，同时，可通过调节电解液配比和实验电参数调整膜层厚度，还可通过添加促进骨结合的化学成分提高种植体的生物相容性和骨引导性，为研制即刻或早期负重种植体提供了更多的机会[2]。
有文献报道，Zn作为人体重要的微量元素，有助于细胞增殖分化及有关酶系统发挥其功能活性，加速骨的形成和钙化从而促进骨折愈合[3]，同时Zn还具有抑菌性能[4]。本课题组前期已通过MAO法在钛表面成功制备含Zn活性涂层，本研究拟对该活性涂层的微观形貌作进一步观察，并建立兔下颌骨种植体植入模型，通过动物实验观察和评价含Zn活性涂层种植体的骨结合界面情况，探讨Zn元素的加入对骨结合的影响。
健康清洁级日本大耳白兔8只，雌雄不限，5月龄，体质量1.8~2.5 kg，由中国医科大学动物部提供。直径3.5 mm、长度5 mm的纯钛TA4圆柱形种植体由东北大学提供。Philips XL30-FEG场发射扫描电镜（荷兰Philips公司），Motic K体视显微镜（德国Motic公司），ULTRA55 3D表面形貌仪（德国Zeiss公司），EXAKT 40硬组织切片机（德国EXAKT公司）。种植体涂层制备由中国科学院金属研究所完成，电解液由Ca（CA）2、Na5P3O10和ZnCl2配制而成，MAO处理采用自制脉冲直流微弧氧化设备，具有正向和反向2种脉冲方式。其中正向电压可调节范围为0~600 V，反向电压可调节范围为0~100 V，脉冲频率为50~1 000 Hz。电解槽为容积5 L的塑料池，以石墨为阴极、种植体为阳极进行表面处理，2组电解液的成分如表1所示。实验组为MAO-Zn/Ca/P涂层种植体；对照组为MAO-Ca/P涂层种植体。
2组电解液成分及浓度（mol/L）
2组电解液成分及浓度（mol/L）
| 组别 | Ca（CA）2 | Na5P3O10 | ZnCl2 |
|---|---|---|---|
| MAO⁃Ca/P | 0.08 | 0.02 | 0.00 |
| MAO⁃Zn/Ca/P | 0.08 | 0.02 | 0.01 |
注：MAO—微弧氧化
将涂层制备完成后的种植体进行干燥、喷金，用扫描电镜在3 000倍放大率的条件下观察种植体的表面形貌，同时应用3D表面形貌仪在白光共聚焦模式下对样品的3D形貌特征进行分析，测量表面孔径大小和粗糙度。
实验兔均单笼饲养，自由进食，室温控制在25 ℃左右，观察1周后用于实验。用速眠新Ⅱ注射液（0.15 ml/kg）对实验兔进行肌注麻醉后将其侧卧位固定于兔台上，对其双侧下颌骨体部外侧手术相应区域剃毛，1%碘伏配合75%乙醇局部皮肤消毒；铺无菌手术巾，依次切开皮肤、筋膜和骨膜，剥离骨膜暴露骨面，在生理盐水充分冷却下用组合钻制备种植窝；一侧随机植入2枚MAO-Zn/Ca/P涂层种植体（实验组），另一侧植入2枚MAO-Ca/P涂层种植体（对照组）；用庆大霉素局部冲洗，依次将骨膜、肌肉和皮肤分别缝合，碘伏消毒创缘。手术后对兔连续肌注庆大霉素3 d（4×105 U/d），保持创口清洁，并密切观察伤口愈合及精神状态。
分别于术后4周、12周将兔处死，取出种植体依次固定、脱水、干燥、粘台、喷金，用扫描电镜观察种植体表面形貌并用X射线能谱分析系统进行种植体表面物质元素分析。用体视显微镜观察种植体，截取3个视野并用Photoshop CS2软件计算种植体表面附着的骨质面积比例，取平均值作为骨质覆盖率。
将术后12周的对照组和实验组标本用硬组织切片机沿种植体长轴切开，标本表面喷金镀膜后，在扫描电镜下用X射线能谱分析系统对2组的种植体骨结合界面进行元素线扫描分析，分析结合界面上Ca、P元素的变化。
采用SPSS13.0统计学软件处理数据，符合正态分布的计量资料以均值±标准差（
±s）表示，2组间均值比较采用t检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。
扫描电镜可见，对照组和实验组种植体表面均呈微孔状氧化层结构，且微孔排列均匀紧密，孔隙边缘向外围突起。3D表面形貌仪分析结果显示，对照组孔径为0.5~1.5 μm，粗糙度为（1.16±0.02）μm；实验组孔径为1.0~4.0 μm，粗糙度为（1.55±0.03）μm（图1）。
扫描电镜结果显示，种植体植入4周后，骨组织对2组种植体表面反应大致相同，均在种植体表面形成一层富含骨基质样的物质，其中对照组可见基质小球分散于等离子体电解氧化膜孔隙中，而实验组中基质小球更为密集（图2）；种植体植入12周后，2组种植体表面均覆盖粗大的纤维样组织，其中对照组隐约可见微弧氧化孔隙结构，而实验组种植体几乎被纤维样组织与新生骨组织全部覆盖（图3）。
种植体表面元素分析结果显示，随着时间的延长，对照组和实验组的C、O元素含量均升高，说明种植体表面黏附的物质主要为有机物层。同时，2组的Ca、P元素含量亦随时间的延长而升高，且实验组的Zn元素与Ca、P元素含量有相同的趋势。（图4、图5）
用体视显微镜观察取出的种植体，统计2组种植体表面的骨质覆盖率，结果表明，骨质覆盖率随时间的延长而升高。术后4周和12周时，实验组种植体表面的骨质覆盖率均高于对照组，且附着的骨组织更厚，其中术后12周时2组间骨质覆盖率差异具有统计学意义（P<0.05）。（表2）
两组种植体表面的骨质覆盖率比较（
±s，n=8）
两组种植体表面的骨质覆盖率比较（±s，n=8）
| 组别 | 术后4周 | 术后12周 |
|---|---|---|
| 对照组 | （28.9±10.9）% | （55.9±13.8）% |
| 实验组 | （37.5±12.3）% | （70.8±13.6）%a |
注：对照组植入微弧氧化-Ca/P涂层种植体，实验组植入微弧氧化-Zn/Ca/P涂层种植体。与对照组比较，aP<0.05
元素线扫描结果显示，术后12周对照组和实验组的骨结合界面处均存在钙磷区，其中对照组钙磷区厚度为30~40 μm，而实验组存在一层厚度为70~80 μm的高钙高磷区，此区域的Ca、P含量与涂层及骨中的Ca、P含量相当（白色箭头示）。表明有生物类骨磷灰石形成，该磷灰石层转化为成熟骨组织并与涂层形成紧密的骨结合。（图6）
MAO技术是近年来在阳极氧化基础上建立起来的一项在有色金属表面原位生长陶瓷膜的新技术。该技术是应用电化学方法，通过火花放电时在微弧区瞬间高温烧结作用，直接在钛基体表面原位生成多孔的氧化钛陶瓷膜，该膜层厚度均匀，与基体间结合牢固，耐腐蚀性强。通过控制电参数和改变电解液成分，可任意调节陶瓷膜的微结构、化学组成和晶体结构，从而改变膜层的性能[5]。有研究结果表明，钛种植体表面粗糙度的增加可增强磷酸钙盐的沉积，提高成骨细胞对蛋白质和Ca2+的摄取能力，而多孔粗糙的钛表面有利于人成骨细胞的附着、增殖和分化功能的表达，增强种植体与骨组织间的结合力[6]。笔者采用场发射扫描电镜观察发现，经MAO处理的种植体表面粗糙多孔，呈交织网状结构，为骨细胞附着和骨组织生长提供了较理想的材料表面形貌。实验组的粗糙度（（1.55±0.03）μm）高于对照组（（1.16±0.02）μm），说明Zn元素的加入使涂层表面形貌上存在优势。
前期细胞实验结果证实，低含量Zn活性涂层有利于成骨细胞的附着、增殖分化和功能表达[7]。Zn是人体重要的微量元素，是机体中参与生理功能最多的微量元素之一。其在DNA合成、蛋白质代谢等方面均发挥重要作用，加速骨的形成和钙化，同时还具有良好的抗菌性，能有效抑制致病菌的滋生[4,8]。本研究建立了兔下颌骨种植体植入动物模型，评价种植体骨结合界面情况，以期在动物水平探讨Zn元素的加入对骨结合的影响，为开发具有良好骨结合性和潜在抗菌性能的种植材料奠定理论基础。
国内外多数学者进行兔种植体植入实验所选的位点为兔胫骨，但兔胫骨皮质骨较薄，骨髓腔较大，松质骨量较少，难以较真实地模拟临床上颌骨这一种植位点的真实特征，故临床评价可比性相对较差[9]。笔者通过预实验体外解剖了解了兔下颌骨的结构，虽可选区域有限，增加了手术难度，但保留颌骨作为种植区，能相对真实地模拟临床种植位点的骨质结构特点[10]。兔下颌骨颊舌向宽度为5.5~7.0 mm，通过制作合适长度及直径的种植体及相对准确的预备种植窝，可保证种植体具有良好的初期稳定性，从而成功建立兔下颌骨种植体植入模型，使实验结果更客观真实。
植入颌骨内的种植体与周围新生骨组织形成结构上的直接结合，即骨结合，为种植义齿负重提供了足够的种植体-骨结合强度，而种植体植入成功的关键环节是如何保证钛种植体与骨组织界面发生骨结合。种植体植入4周后的扫描电镜结果显示，骨组织对2组种植体表面反应大致相同，均在种植体表面形成一层富含骨基质样的物质，X射线能谱分析发现该层物质主要含C、O元素，说明形成的主要是有机物层，Davies和Baldan[11]研究认为，该有机物层是由成骨细胞分泌的骨基质层，即2组种植体表面均有骨传导作用，而种植体的骨结合在很大程度上依赖于生物材料的骨传导性，实验组的骨质覆盖率高于对照组说明Zn元素的加入更易引起骨组织的积极反应，该基质层可为钙磷矿化提供成核位置。
种植体植入12周后，2组种植体的骨反应不同，实验组的骨质覆盖率显著高于对照组（P<0.05），且扫描电镜结果显示实验组的新生骨组织更厚。为进一步分析涂层与骨组织结合界面处元素的分布，对界面进行元素线扫描分析，结果显示对照组种植体骨结合界面处的钙磷区厚度约30~40 μm，而实验组存在70~80 μm厚的高钙高磷区，其为沉积的生物类骨磷灰石层[12,13]。上述结果表明，含Zn活性涂层更易诱导类骨质钙化成熟，形成矿化较好的骨组织，并与涂层形成紧密的骨结合，这与Li等[14]的研究结果一致。
综上所述，MAO-Zn/Ca/P涂层的生物学活性显著优于MAO-Ca/P涂层，且Zn元素参与了骨组织的代谢过程，表明Zn元素的加入能提高涂层的生物活性，增强涂层的成骨能力，并促进种植体与骨组织界面的结合。本研究为种植材料的开发奠定了理论基础，但对于该活性涂层应用于临床还需进一步的研究。
无
