核因子E2相关因子2（Nrf2）蛋白作为一种核转录因子，在调节细胞内氧化还原平衡以及细胞抵抗各种应激中发挥着重要作用。氧化应激和电离应激可引起Nrf2从细胞质向细胞核转移，入核的Nrf2结合抗氧化反应元件调节NQO1、HO-1等抗氧化基因的转录，对细胞起到抗氧化保护作用。近年来研究结果显示，包括肺癌在内的许多癌细胞存在Nrf2过表达现象，且Nrf2的蛋白水平与肺癌的发生、发展、放化疗抵抗及患者的预后等均存在一定联系。Nrf2或其抑制蛋白Keap1突变导致的肺癌细胞中Nrf2蛋白含量过高会促进肺癌细胞的增殖和迁移，导致肺癌细胞的放化疗抵抗，可作为肺癌患者不良预后的标志。总结了Nrf2的结构、功能和调节，并对Nrf2基因在肺癌发生、发展和治疗中的作用机制研究进展进行了综述。
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核因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid-2-related factor 2，Nrf2）属于CNC亮氨酸拉链转录激活因子家族，是细胞维持氧化还原平衡、抵抗氧化和电离应激的主要调节因子。正常情况下，Nrf2主要存在于细胞质中。Nrf2与Keap1结合会促使Nrf2发生泛素化，泛素化的Nrf2被转运至26S蛋白酶体降解。通过Keap1的调节，可维持Nrf2在细胞质中的动态平衡。然而在氧化应激或电离应激条件下，Keap1结构发生变化释放Nrf2，胞质中游离稳定的Nrf2会发生核转位，而后通过与抗氧化反应元件（antioxidant response element，ARE）结合发挥核转录因子作用，调节一系列抗氧化、解毒基因的表达，对细胞起到保护作用。
肺癌是全世界发病率和死亡率最高的癌症。肺癌患者的临床常规治疗通常采用化学药物治疗（化疗）结合放射治疗（放疗）。放疗和一些化疗药物主要通过增加细胞内的活性氧来发挥细胞毒作用。近年的研究结果发现，肺癌细胞多存在Keap1或Nrf2突变，导致Nrf2在肺癌细胞中过表达，而过表达的Nrf2会促进肺癌细胞的增殖和转移，使肺癌细胞产生放化疗抵抗。探究及总结Nrf2在肺癌细胞增殖、分化和转移中的作用及导致肺癌细胞放化疗抵抗的机制，有助于研发更有效的肺癌治疗药物。
20世纪90年代前，人们对Nrf2知之甚少，仅有少数研究涉及其通过抗氧化应激和亲电子应激来发挥保护细胞的作用。近年来随着人们对Nrf2结构、功能和调节的逐渐了解，Nrf2及其固有抑制蛋白Keap1引起了研究人员的广泛关注，成为研究人员的争论焦点[1]。争论主要围绕Nrf2在肿瘤形成和抑制中的角色展开，进而引出Nrf2能否作为肿瘤预防和抗肿瘤药物靶点的问题。要想准确定位Nrf2，首先应了解其结构、功能和相关调控机制。
Nrf2蛋白有7个功能结构域：Neh1~Neh7。Neh1含有基本的亮氨酸拉链结构，是结合sMaf、DNA和其他转录因子的结构域。Neh1还可结合泛素连接酶，进而调节Nrf2的稳定性和转录功能[2]。Neh2是Nrf2的N端结构域，包含DLG和ETGE基序，两者均可与Keap1结合，从而调节Nrf2的泛素化和稳定性。其中，ETGE结合Keap1的能力较DLG强[3,4]。Neh3是Nrf2的C端结构域，可与转录活化剂CHD6相互作用，调节ARE相关基因的表达[5]。Neh4和Neh5结构域可与另一种转录活化剂CBP结合，或与核共调因子RAC3/AIB1/SRC-3结合，调控Nrf2的靶基因[6]。另外，Neh5还可感受氧化还原敏感的核输出信号，从而调节Nrf2在细胞内的定位[7]。Neh6富含丝氨酸，包含DSGIS和DSAPGS基序，两者与β-转导素重复序列包含蛋白（β-TrCP）和糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）结合后再连接Skp1-Cul1-Rbx1/Roc1形成泛素化连接酶复合物，这样就形成了一条非依赖Keap1的Nrf2泛素化降解途径[8,9]。Neh7可结合核受体维甲类X受体α（retinoid X receptor α，RXRα），进而抑制Nrf2-ARE信号通路[10]。
Nrf2的主要功能是调节基因转录，发挥细胞保护作用。首先，Nrf2可调控抗氧化基因和Ⅱ相酶表达，如HO-1、NQO1、GSTs基因以及γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶、谷胱甘肽过氧化物酶、硫氧还原蛋白还原酶1（TrxP1）、过氧化物氧化还原酶1、醛氧化酶等，从而维持细胞稳态，降低细胞毒作用，使细胞抵御来自外界和自身的物理或化学损害。其次，Nrf2可促进一些多药耐药家族基因的转录表达，如MRP1、MRP2、MRP3和MRP4等，故Nrf2可能是肿瘤细胞产生放化疗抵抗的重要原因[11]。有研究结果发现，Nrf2参与了调节干细胞的功能。在果蝇中持续活化的Nrf2可维持肠干细胞中的低水平活性氧，有利于肠干细胞处于静息状态而维持细胞多潜能性[12]。Nrf2还可通过调节Notch1信号通路来促进造血干细胞和支气管上皮基底干细胞的增殖和分化[13,14]；Nrf2对蛋白酶体功能的影响使其成为人胚胎干细胞自我更新和维持多潜能性的重要调节因子[15]；而Nrf2对肿瘤干细胞的调节作用使肿瘤干细胞对各种疗法产生强抵抗，从而导致不良预后[16]。还有研究结果发现，Nrf2可通过调节DNA损伤修复过程来影响细胞对电离辐射和化学药物的敏感性，在维持基因组的稳定中发挥重要作用[17,18]。
Keap1蛋白富含巯基，是电离应激和氧化应激的传感器，亦为目前已知的调节Nrf2稳定性和丰度的主要调节因子。正常情况下，Nrf2在细胞质中与其固有的抑制蛋白Keap1结合。Keap1的衔接蛋白Cul3可介导Nrf2泛素化进而使其转移至26S蛋白酶体降解[19,20,21]。当细胞受条件诱导或处于氧化、亲电子应激时，Keap1发生变化，Nrf2便可从复合物中分离出来，逃脱蛋白酶体的降解。然后，Nrf2以稳定形态存在，并聚集转移进入细胞核，与sMaf及其他转录调控蛋白形成复合物，这样被募集的Nrf2便可结合到ARE上调控一系列细胞保护基因的表达[11]。
Nrf2还受磷酸化调节。有文献报道，蛋白激酶C可使Nrf2 Ser40磷酸化，进而增强Nrf2的稳定性[22]。与此同时，蛋白激酶C导致的Nrf2磷酸化还可使Nrf2从Keap1的复合物中解离，这也有利于增强Nrf2的稳定性，但不能促进游离的Nrf2向核内聚集发挥其转录因子作用[23]，而酪蛋白激酶2导致的Nrf2 TA结构域磷酸化却可促进Nrf2向核内聚集并活化[24]。以上两种磷酸化形式均可增强Nrf2的功能，但也有研究结果显示，Nrf2其他位点的磷酸化或许会促进其向核外转移或降解，从而不利于其发挥保护细胞的功能。例如：Nrf2 Tyr568的磷酸化会促进Nrf2由胞核向胞质转移，并促进Nrf2的降解过程[25]。在体内外GSK-3β均可使Nrf2磷酸化，这种磷酸化会促使Nrf2转移出细胞核而削弱其核转录因子作用，导致其下游的HO-1等基因表达降低，抗氧化保护作用减弱[26]。
除受Keap1、磷酸化调节外，Nrf2-ARE信号通路还受一系列核受体的调节（表1）[27]。
影响Nrf2-ARE信号通路的核受体
影响Nrf2-ARE信号通路的核受体
| 核受体 | 配体 | 作用 | 细胞/组织类型 |
|---|---|---|---|
| PPARγ | 前列腺素J2/噻唑烷二酮曲格列酮 | 直接结合Nrf2并抑制其反式激活作用 | 大鼠巨噬细胞 |
| 雌激素受体α（ERα） | 17β⁃雌二醇 | 结合Nrf2并抑制其反式激活作用 | MCF⁃7/COS⁃1/Ishikawa细胞 |
| 维甲酸受体α（RARα） | 全反式维甲酸/AM580 | 与Nrf2形成蛋白复合物 | MCF⁃7/小鼠小肠 |
| 维甲酸受体γ（RARγ） | 全反式维甲酸 | 未知 | MCF⁃7 |
| 维甲类X受体α（RXRα） | 未检测 | RXRα的DNA结合域直接结合Nrf2的Neh7结构域并抑制其反式激活作用 | A549/Caco⁃2/MCF⁃7/小鼠肝脏 |
| 雌激素相关受体β（ERRβ） | 未知 | 与Nrf2物理作用并抑制其反式激活作用 | COS⁃1/Ishikawa细胞 |
| 糖皮质激素受体（GR） | 11β⁃羟基类固醇脱氢酶1/地塞米松 | SMRT与Neh4/Neh5结合并抑制Nrf2作用 | H4IIE/HEK293/ARECS3/大鼠肝脏 |
注：Nrf2—核因子E2相关因子2；ARE—抗氧化反应元件；PPARγ—过氧化物酶体增殖物激活受体γ；SMRT—维甲酸和甲状腺激素受体沉默调节因子
目前，关于Nrf2蛋白稳定性、丰度和活性的调节已有诸多报道，但更准确和详细的分子机制还有待于进一步探索，如：除了Keap1依赖的泛素化降解途径，是否还有其他途径对Nrf2的稳定性和降解进行调控；Nrf2如何被活化并转运聚集至细胞核发挥转录因子作用。另外，近年来对Nrf2的研究已不再局限于核转录因子功能，与其他信号通路间的相互调节作用以及抗氧化功能外的其他功能已成为研究的热点。Nrf2与mTOR信号通路[28]、Notch信号通路[14]、Wnt信号通路[29]间的相互调节为今后开展对Nrf2功能的研究开拓了新思路。Nrf2作为细胞生命过程中的重要蛋白，在肿瘤发生和肿瘤细胞生命过程的调节中发挥着重要作用。目前Nrf2在肺癌中的功能研究较多，下文对Nrf2在肺癌中的研究进展进行概述。
研究结果显示，Nrf2在多种肿瘤形成及预防过程中扮演着重要角色。奥替普拉对肝脏、膀胱和胃部肿瘤的化学预防作用可能是因其激动了Nrf2及下游抗氧化剂的解毒作用[30,31]；Nrf2基因敲除小鼠更易发生皮肤肿瘤，而萝卜硫素对皮肤肿瘤的化学预防作用可能是以Nrf2为靶点[32]。大量关于肺癌发生的研究同样证明了Nrf2在肿瘤预防中起重要作用。在尿烷诱导的小鼠肺癌模型中，Nrf2基因敲除小鼠的肺癌发生时间明显早于野生小鼠[33]；而在Keap1敲除小鼠（Nrf2蛋白高表达小鼠）中，尿烷诱导的肺癌发生率明显低于野生小鼠[34]。由此可见，Nrf2激动剂或许可有效预防肺癌的发生。萝卜硫素、姜黄素、白藜芦醇、合成齐墩果烷三萜类化合物、奥替普拉等是目前已知的Nrf2激动剂，其中萝卜硫素、奥替普拉等已作为化学预防药物进入临床试验。这些Nrf2激动剂多通过与Keap1结合释放Nrf2起到激动Nrf2的作用，继而激动抗氧化、抗炎和解毒信号通路，对细胞发挥多重保护作用，防止癌症发生[35,36]。但是，最近有文献报道CDDO-Im、CDDO-Me和二甲基甲酰胺均可激动Nrf2信号通路，但因靶向基因和信号通路不同导致它们在预防肺癌发生中表现出相反的作用[37]。由此可见，这些Nrf2激动剂是否是因为激活Nrf2信号通路而预防肺癌发生还有待于更准确和详尽的机制研究来证明。筛选和开发有效、无不良反应的Nrf2激动剂作为肺癌化学预防药物任重而道远。
Satoh等[38]在肺癌转移模型中发现，Nrf2基因敲除小鼠较野生型小鼠更易发生肺癌转移，且Keap1突变Nrf2过表达的小鼠表现出肺癌转移的抗性。这是由于Nrf2可通过调节移植肿瘤细胞周围微环境的活性氧水平和炎症反应，起到抑制肿瘤细胞转移的作用。由此可见，Nrf2缺失不但有利于肺癌的原发，还为肿瘤的转移侵袭提供了有利的微环境。在尿烷诱导的小鼠肺癌模型中，Nrf2基因敲除小鼠虽在早期表现出肺癌易感，但在后期的肿瘤发展过程中野生小鼠肺癌肿瘤细胞中多出现Kras突变，表现出更强的恶性，更易形成转移型肺癌[33]。因此，通过调节Nrf2来进行肺癌化学预防一定要把握一个度。虽然低水平的Nrf2会导致肺癌易感，但一旦细胞癌变还一味激动Nrf2反而会造成肺癌的恶化和转移。
临床数据显示，在肺癌患者中Keap1或Nrf2存在很高的突变率，且这些突变直接影响临床疗效和患者的生存率[39,40]。在非小细胞肺癌中，Keap1等位基因突变率较高，Keap1的失活会导致Nrf2无法通过泛素化蛋白酶体途径降解，使Nrf2在肺癌细胞中高表达；高表达的Nrf2进而促进抗氧化基因、药物泵出基因等的过表达，导致肺癌细胞的增殖、侵袭和解毒能力增强。此外，Nrf2高表达的肺癌细胞对顺铂等化疗药物亦表现出很强的抗性[41,42]。
有文献报道，在肺鳞癌细胞中Nrf2突变与RagD基因表达具有相关性，Nrf2突变会增加细胞内RagD的mRNA水平，而较高水平的RagD mRNA与患者的不良预后相关。RagD是近来发现的mTOR信号通路激动剂，故Nrf2突变还有可能通过影响mTOR信号通路来促进细胞增殖、转移、血管生成和抗性增强，并与肺癌患者的不良预后相关[28]。另有学者通过研究分析无吸烟史女性肺癌患者的治疗状况，认为Nrf2基因中的单核苷酸多态性（-617C>A）可作为肺腺癌患者的预后生物标志物[43]。此外，Nrf2还与神经胶质瘤干细胞的抗性、自我更新能力有关，但未见Nrf2影响肺癌干细胞的报道。
Nrf2或Keap1突变会导致肺癌细胞的Nrf2高表达，继而促进肺癌细胞增殖，增强肺癌细胞对化疗药物或放疗的抗性[44,45]。因此，Nrf2和Keap1有望成为治疗肺癌的重要靶点，激活Keap1或抑制Nrf2可抑制肺癌细胞过度增殖，增强肺癌细胞对放化疗的敏感性。目前，以Nrf2或Keap1为靶点的药物正处于研发中。其中，木樨草素在体内和体外均能有效抑制Nrf2信号通路，抑制肺癌细胞的增殖，增强肺癌细胞对化疗药物的敏感性[46,47]；IM3829能通过抑制Nrf2来升高肺癌细胞内的活性氧水平，增强肺癌细胞对电离辐射的敏感性，可作为高表达Nrf2肺癌患者的放疗增敏剂[48]；鸦胆子苦醇能通过抑制Nrf2来升高肺癌细胞A549内的活性氧水平，增加DNA损伤而直接杀死肺癌细胞，并增强其对电离辐射的敏感性[49]；3′，4′，5′，5，7-五甲氧基黄酮（PMF）亦为一种以Nrf2为靶点的有效化疗增敏药物[50]。
随着对Nrf2结构、功能和调节的认识不断深入，Nrf2在由氧化应激或炎症导致的慢性病和癌症等疾病中的重要作用逐渐受到人们的重视。近年来，研究人员通过基因测序发现，许多癌症均存在Keap1-Nrf2信号通路突变的现象，尤其是肺癌、膀胱癌和头颈癌。Keap1或Nrf2的突变多导致Nrf2过度活化及其下游细胞保护基因过表达。过高或过低的Nrf2往往是肺癌患者不良预后的罪魁祸首。大量的研究结果已表明，Nrf2在癌症的发生、发展、治疗、抗性和预后中扮演了重要角色。
然而，在对肺癌的预防和治疗过程中，应激动Nrf2还是抑制Nrf2仍存在争议。例如在肺癌研究中，食用具有Nrf2激动作用的食物确实有预防肺癌发生的作用。然而，在临床病例中，研究人员发现很多肺癌细胞存在Nrf2过表达现象，且过表达的Nrf2正是导致肺癌细胞过度增殖和产生放化疗抵抗的重要原因。由此可见，Nrf2到底是好是坏，在癌症的治疗过程中究竟如何调节Nrf2才能达到最佳疗效还有待更深入的研究。由于目前研发的一些药物抑制或激动Nrf2的机制并不明确，因此要想把它们真正转化成为有效的临床使用药物还有很多机制需要阐明。此外，治疗肺癌和增强肺癌放化疗敏感性的药物如何准确靶向肺癌细胞而不影响正常组织细胞也是研究人员面临的巨大挑战。随着Nrf2在细胞中功能的更详尽阐明以及单一靶向性Nrf2激动剂和抑制剂的发现，Nrf2有望成为治疗更多疾病的有效靶点。
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