探讨绿原酸对结肠癌细胞增殖和凋亡的调控机制。
流式细胞术检测不同浓度的绿原酸对人结肠癌细胞株HT-29细胞凋亡的影响，噻唑蓝（MTT）法检测细胞增殖，Transwell检测细胞迁移。建立HT-29细胞的裸鼠荷瘤模型，实验组在肿瘤区域注射100 μl绿原酸溶液（100 mg/L），对照组在肿瘤区注射100 μl生理盐水。跟踪测量肿瘤体积与质量，用免疫印迹法检测AKT/GSK-3β信号通路相关因子的蛋白表达水平。
绿原酸能显著促进HT-29细胞凋亡（P<0.01），抑制细胞增殖（P<0.01)，抑制细胞迁移（P<0.05），且均呈现剂量依赖趋势。绿原酸处理的HT-29荷瘤模型小鼠无转移瘤出现。在各时间点，实验组裸鼠肿瘤体积和质量均明显小于对照组（均P<0.05）。2组裸鼠肿瘤组织中丝氨酸/苏氨酸激酶（AKT）和糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）表达差异无统计学意义（均P>0.05），但实验组相关磷酸化蛋白p-AKT、p-GSK-3β、β-catenin明显低于对照组（均P<0.01）。
绿原酸可抑制结肠癌细胞的增殖和转移、促进细胞凋亡，其机制可能是通过AKT/GSK-3β信号通路实现。
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结肠癌是发生于结肠部位的一种常见消化道恶性肿瘤，其在我国恶性肿瘤发病率和死亡率分别居第3位和第5位，且其发病率呈增长趋势[1,2]。目前，化学治疗在结肠癌的综合治疗中处于主导地位。近年来，中医药在结肠癌的预防和治疗中的作用越来越受到重视，并对中药预防和治疗结肠癌的可能机制开展了研究[3]。绿原酸（chlorogenic acid，CGA）是存在于多种中草药的一种活性成分，具有诸多生物学活性，如抗炎、抗病毒、降血脂和血糖、抗氧化作用、增强机体免疫力等[4,5]。现代药理实验证明，杜仲CGA可通过降低致癌物的利用率及其在肝脏中的运输来达到防癌、抗癌的效果。此外，在体实验已证实CGA能抑制结肠癌细胞的成瘤效应[6,7]。本研究在以往研究基础上，通过离体和在体实验探究CGA对结肠癌细胞增殖与凋亡的调控机制。
实验用BALB/c-nu裸鼠为4周龄SPF级健康雄性小鼠（n=30），体质量为（18.77±1.02）g，购自北京华阜康生物科技有限公司，许可证号：SCXK（京）2014-0004。CGA（250 mg Rutin hydrate，>98%）（美国Sigma-Aldrich公司），McCoy's 5A（Modified）Medium肉瘤细胞培养液、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）（美国Thermo Fisher公司），Annexin V-FITC试剂盒（深圳欣博盛生物科技有限公司），磷酸化丝氨酸/苏氨酸激酶（phospho-serine/threonine kinase，p-AKT）、AKT抗体（美国Cell Signaling Technology公司），糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase 3 beta，GSK-3β）、磷酸化糖原合成酶激酶-3β（p-GSK-3β）、β-链蛋白（β-catenin）、β-肌动蛋白（β-actin）抗体（美国Abcam公司），人结肠癌细胞株HT-29（中国医学科学院中国协和医科大学细胞库），人源表皮生长因子（epidernal growth factor，EGF）（美国Chemicon公司)，辣根过氧化物酶标记羊抗鼠（horseradish peroxidase-labeled goat anti-mouse，IgG-HRP）（美国Abmart公司），快捷型酶标羊抗鼠/兔IgG聚合物（HRP-Polymer anti Mouse/Rabbit IgG）（福州迈新生物技术开发有限公司）。Transwell小室（美国Corning公司），Accuri C6流式细胞仪（美国BD公司）。
人结肠癌细胞株HT-29培养于含100 μg/ml青霉素、链霉素和10% FBS的McCoy's 5A培养液中，置于37 ℃、5%CO2孵箱中培养，每2天换液1次，每3~4天用胰蛋白酶消化液消化传代1次，取对数生长期细胞用于实验。
将对数生长期HT-29细胞接种于6孔板，每孔1×106个，培养24 h后，对照组不进行处理，实验组加入系列质量浓度梯度的CGA培养基（CGA的质量浓度分别为10、25、50、100 μg/ml），每个浓度复孔3个[8,9,10]；处理48 h后，收集细胞，用150 μl上样缓冲液（bingding buffer）重悬细胞，加入1.5 ml离心管中，再加入异硫氰酸荧光素标记的膜联蛋白V（Annexin V-fluorescein isothiocyanate，Annexin V-FITC）10 μl，避光冰浴20 min后加入10 μl 7-氨基放线菌素D（7-aminoactinomycin D，7-AAD），混匀后用流式细胞仪检测细胞凋亡。
将对数生长期HT-29细胞接种于96孔板中，每孔1×105个。空白对照为不加任何试剂的空孔；对照组不进行任何处理；检测组中，CGA处理方法同前，处理48 h后，每孔加入20 μl质量浓度为5 g/L的噻唑蓝（thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT）试剂，置于37℃、5%CO2的细胞培养箱中孵育4 h后吸出，加入150 μl二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）试剂，充分震荡溶解结晶后，用多功能酶标仪测定在450 nm的吸光度（A）。细胞增殖抑制率的计算公式为
在Transwell小室（24孔板，膜孔径8.0 μm）聚碳酸酯膜上，每孔加入1640培养基200 μl；下室中加入EGF或10% FBS培养基，600 μl/孔；上室孔中加入细胞1×105个/孔，对照组加入未经处理的HT-29细胞，实验组加入CGA处理的细胞（处理方法同前），细胞悬液体积200 μl，置于37 °C、5%CO2培养箱中培养24 h；待培养结束后，弃去上室液体，小心取出上室，用湿棉签擦去膜上未穿过膜的细胞；4%中性甲醛固定10 min，结晶紫染色10 min，磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）冲洗3次，干燥后取下微孔滤膜；在倒置显微镜下直接观察穿过膜的细胞，在每张膜中央部分和周围部分各随机取3个视野，对每个视野内的穿过8 μm微孔的细胞进行计数。
裸鼠在无特定病原体条件下于层流架内饲养。将生长状态良好且处于对数生长期的HT-29细胞植于裸鼠皮下，每只接种2×106个细胞，共接种30只，接种后常规饲养并观察裸鼠成瘤情况。接种2~3周后，肿瘤体积约1 cm3时，选择肿瘤体积接近的20只小鼠，随机平均分为对照组和实验组。每日10∶00 AM，实验组在肿瘤区域注射100 μl CGA溶液（100 μg/ml），对照组注射100 μl生理盐水。连续观察4周并记录肿瘤的生长情况，每周测量肿瘤长径（L），短径（W）。肿瘤体积（V）计算公式为
注射处理4周后处死小鼠，取瘤称重并检查肝、肺部肿瘤的转移情况。将每个肿瘤样本平均分成2份，1份于-80 ℃保存，用于提取瘤组织蛋白，另1份用石蜡包埋处理后进行苏木精-伊红（HE）染色，观察病理。
将肿瘤组织置于预冷的组织匀浆器中，加入预冷的蛋白裂解液快速匀浆，提取组织总蛋白，将蛋白加热变性后保存。采用BCA（bicinchoninic acid）法对蛋白进行定量并绘制标准曲线；根据标准曲线拟合方程计算样品蛋白质量浓度，后行聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后转膜；进行相关抗原封闭、抗体孵育，检测AKT、p-AKT、GSK-3β、p-GSK-3β、β-catenin、β-actin蛋白的表达。一抗稀释浓度均为1∶1 000，4 ℃过夜，二抗为IgG-HRP或快捷型酶标羊抗鼠/兔IgG聚合物，37 ℃孵育60 min。
使用SPSS 18.0软件处理数据，所有数据以均数±标准差（
±s）表示，使用双侧样本Student'st检验比较组间数据的差异，以P<0.05为差异具有统计学意义。
CGA处理HT-29细胞48 h后，在倒置显微镜下观察细胞状态。结果表明，对照组细胞生长状态较好，实验组细胞体积变小，细胞间隙增大，少部分细胞断裂破碎，悬浮在培养液中；随着CGA质量浓度的升高，越来越多的细胞脱落悬浮、破碎。细胞凋亡流式检测结果显示，与对照组相比，不同质量浓度的CGA对HT-29细胞凋亡具有明显的促进作用，其差异具有统计学意义（均P<0.01），且呈剂量依赖趋势。（图1）
与对照组比较，aP<0.01
CGA处理HT-29细胞48 h后，用MTT检测细胞增殖。结果表明，与对照组相比，不同质量浓度的CGA对HT-29细胞增殖具有明显的抑制作用，其差异具有统计学意义（均P<0.01），且呈现剂量依赖趋势。（图2）
与对照组比较，aP<0.01
CGA处理HT-29细胞48 h后，观察结晶紫染色图片。结果显示，与对照组相比，不同质量浓度的CGA对HT-29细胞迁移具有明显的抑制作用，其差异具有统计学意义（均P<0.05），且呈现剂量依赖趋势。（图3）
HT-29细胞荷瘤小鼠处死后，发现实验组小鼠（注射CGA）无转移瘤出现，对照组（注射生理盐水）中发现有5例肝、肺、结肠微小转移瘤。通过在不同时间点测量荷瘤小鼠肿瘤体积，得到肿瘤生长曲线（图4、图5）。结果表明，注射CGA 4周后实验组肿瘤体积明显小于对照组，其差异具有统计学意义（P<0.05）；实验组肿瘤质量（0.47±0.051）g明显小于对照组（0.73±0.064）g，其差异具有统计学意义（t=8.655，P<0.05）。以上结果表明，CGA能够抑制裸鼠肿瘤的生长。
与对照组比较，aP<0.01
Western Blot结果显示，实验组和对照组裸鼠肿瘤中AKT、GSK-3β表达差异无统计学意义（均P>0.05），但实验组磷酸化蛋白p-AKT、p-GSK-3β和β-catenin明显低于对照组，差异具有统计学意义（均P<0.01）。（图6）
与对照组比较，aP<0.01
CGA类物质是植物重要的次生代谢产物，广泛存在于高等双子叶植物和蕨类植物中，在杜仲、金银花、咖啡等植物中含量较高[8,9]。CGA类物质可通过调节细胞周期、诱导凋亡、抑制细胞生长等途径产生抗癌作用，对肺癌、乳腺癌、肝癌具有显著的抑制作用，被认为是癌症的有效化学防护剂[10,11,12]。萧海蓉等[7]研究表明，CGA类物质对CT-26结肠癌移植瘤有明显的抑制作用，推测CGA类物质有一定的抗结肠癌活性。
本研究结果表明，CGA可以抑制HT-29结肠癌细胞增殖、促进细胞凋亡，且其效果呈现剂量依赖趋势。通过Transwell细胞迁移实验发现，CGA可明显抑制HT-29结肠癌细胞的迁移。基于裸鼠荷瘤模型的实验结果表明，CGA能够抑制裸鼠肿瘤的增长速度；同时，CGA处理组裸鼠无转移瘤的出现。在体实验证实了CGA对结肠癌细胞的增殖、凋亡和迁移起到明显的调控作用。以上结果与文献报道一致，即CGA可抑制恶性肿瘤细胞的增殖和迁移，促进肿瘤细胞凋亡[3,7,10,11]。
研究表明，CGA类物质调节细胞存活与凋亡的分子机制主要包括[5,13,14]：①降低细胞生长繁殖信号传导途径中信号因子的强度，进而降低癌细胞的存活力。②提高醌类氧化还原酶—谷胱甘肽S-转移酶（glutathione S-transferase，GST)、尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）抵抗有致癌作用的氧化剂对细胞致癌作用的诱导。③降低丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）等癌化激酶的活性，从而防止细胞癌变。④刺激Nrf2等抑癌基因的表达，抑制癌细胞的生长。
磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3 kinase, PI3K)/AKT通路是人类肿瘤主要信号通路之一，其主要作用包括促进细胞增长、抑制细胞凋亡和下调细胞周期抑制性调控因子，与乳腺癌、卵巢癌、肝癌、大肠癌等多种肿瘤关系密切。GSK-3β是PI3K/AKT信号通路中的重要节点蛋白，具有调节细胞增殖、分化、凋亡等功能，其信号通路与抑制细胞凋亡及促进增殖密切相关[15,16]。随着与GSK-3β相互作用分子的不断发现，GSK-3β在肿瘤形成中的重要作用受到越来越多的关注。GSK-3β在静止细胞中一般较活跃，受磷酸化修饰调节，9位丝氨酸的磷酸化使其活性受抑制。多项研究表明，AKT/GSK-3β信号通路与结肠癌的发生、发展相关[17]。此外，Wnt/β-catenin信号通路在肿瘤的发生发展过程中发挥着重要的作用，是维持肿瘤干细胞特性的一条重要通路，其激活受到AKT/GSK-3β的调节，当AKT磷酸化水平升高并激活时可以磷酸化GSK-3β的9位丝氨酸，从而抑制GSK-3β的活性，阻断GSK-3β对其下游β-catenin的磷酸化；β-catenin的泛素化降解平衡被破坏，导致β-catenin在细胞内的聚集并转移至核内调控靶基因的表达[18,19]。
本研究中，对实验组和对照组AKT/GSK-3β信号通路的Western Blot检测结果显示，实验组和对照组裸鼠肿瘤中AKT、GSK-3β表达差异无统计学意义（均P>0.05），但实验组磷酸化蛋白p-AKT、p-GSK-3β、β-catenin明显低于对照组，差异具有统计学意义（均P<0.01）。在这条信号通路中，CGA的作用机制可能是激活了AKT/GSK-3β信号通路，进而调控下游信号Wnt/β-catenin通路中β-catenin的表达，最终导致结肠癌细胞的凋亡，并抑制了癌细胞的增殖和转移。但信号传导途径是一个复杂的网络结构，CGA的调控途径可能不止一条，其具体作用机制有待进一步研究。
无
