建立稳定表达人ADP核糖基化因子-4（ARF4）的卵巢癌SKVO3细胞系。
构建pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro/ARF4真核表达载体；经测序验证后转染SKOV3细胞，运用实时定量PCR验证ARF4 mRNA的表达量；再将验证后的重组质粒与慢病毒包装质粒共转染HEK-293T细胞进行包装，收集重组慢病毒颗粒LV-ARF4，感染SKOV3细胞后用嘌呤霉素筛选稳定表达的细胞系；最后用实时定量PCR与Western Blot测定稳定表达的细胞系内ARF4的表达情况。
成功构建出pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro/ARF4真核表达载体；该载体在SKOV3细胞中可明显上调ARF4 mRNA的表达，并在HEK-293T细胞中成功包装成重组慢病毒颗粒。与对照组相比，实验组SKOV3细胞感染ARF4慢病毒载体后ARF4 mRNA及蛋白的相对表达水平均明显升高，差异均具有统计学意义（均P<0.001）。
成功构建了重组质粒pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro/ARF4及慢病毒载体LV-ARF4，并建立了ARF4稳定转染的SKOV3细胞系，为进一步研究ARF4在卵巢癌中的生物学功能奠定了基础。
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囊泡转运是真核细胞中大分子与颗粒性物质的主要跨膜运输方式。肿瘤细胞内的物质转运对细胞生长和运动至关重要，它能促进细胞膜、溶酶体等的形成，使细胞能分泌蛋白质、激素和神经递质并通过胞吞作用摄取外源分子[1]。ADP核糖基化因子（ADP-ribosylation factor，ARF）是细胞囊泡转运的关键调节分子。ARF家族属于Ras超家族，Ras超家族十分庞大，包含上百种20~30 ku的鸟苷酸结合蛋白。Ras超家族分为6个家族：Ras、Rho、Rab、Ran、Rad和ARF。其中，根据ARF的大小、氨基酸序列及内含子、外显子的排列，ARF又可进一步分为3类：第一类包括ARF1、ARF2和ARF3，均由181个氨基酸组成，3者间的相似性>96%；第二类包括ARF4和ARF5，均由180个氨基酸组成，两者的相似性为90%；第三类只含ARF6，其氨基酸组成与其他ARF差别很大[2]。有文献报道，ARF1和ARF6参与了肿瘤细胞的迁移及扩散，尤其在胃癌、乳腺癌等肿瘤的发病过程中起着重要作用[3,4,5]。
ARF4最初是作为霍乱毒素催化Gs蛋白α亚基的ADP核糖基化反应的辅助因子而被认识的[6]。研究人员发现ARF4主要参与细胞内的物质转运，在囊泡运输、细胞移动和细胞黏附中均发挥重要作用。另有文献报道，ARF4能被转录因子sLZIP靶向调控并参与高尔基体应急[7]。此外，ARF4还可调节磷脂酶D和P53的活性，并能抑制活性氧簇的生成从而发挥抗凋亡作用[8,9,10,11]。近来Jang等[12]报道了ARF4在人类肿瘤细胞中的作用，在佛波酯（PMA）的诱导下ARF4可参与调控乳腺癌细胞的迁移。芯片数据显示，ARF4是微小RNA-7（microRNA-7）的一个潜在靶基因，而microRNA-7已被证实在多种肿瘤（包括卵巢癌[13]）中具有抑癌作用。考虑到ARF4在物质转运中的功能及卵巢癌高迁移、高复发的特性，有必要对ARF4基因与卵巢癌的关系作进一步研究，而获得ARF4基因高表达的细胞克隆是进一步研究的工作基础。
本研究旨在构建人ARF4基因真核表达质粒并包装慢病毒载体，再转染人上皮性卵巢癌细胞系SKOV3建立稳转细胞系，为深入研究ARF4基因在卵巢癌中的功能奠定基础。
HEK-293T细胞株、SKOV3细胞株、pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro质粒、慢病毒包装质粒PSPAX2、PMD2G（湘雅医院病理科惠赠），RPMI-1640、DMEM培养基（美国HyClone公司），胎牛血清、Opti-MEM培养基（美国Gibco公司），大肠杆菌DH5α感受态（上海生工生物工程公司），慢病毒感染增强剂EnvbirusTM-LV（北京英格恩生物科技有限公司），GoScriptTM Reverse Transcription System逆转录试剂盒、GoTaq qPCR Master Mix荧光定量试剂盒（美国Promega公司），LipofectamineTM 2000、RNA提取试剂TRIzol（美国Invitrogen公司），QIAprep Spin Miniprep Kit质粒抽提试剂盒、QIAquick Gel Extraction Kit胶回收试剂盒（德国Qiagen公司），限制性内切酶、T4 DNA连接酶、虾碱性磷酸酶（rSAP）（美国New England BioLabs公司），RIPA强细胞裂解液、苯甲基磺酰氟（PMSF）（上海碧云天生物技术有限公司），兔抗人ARF4单克隆抗体（美国Proteintech公司），羊抗兔IgG、兔抗小鼠IgG、小鼠抗人甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH）单克隆抗体（湖南艾佳生物科技股份有限公司），预染蛋白Marker（美国Thermo Scientific公司），引物均合成于上海捷瑞公司。
Applied Biosystems 7500定量PCR仪（美国Applied Biosystems公司），Mastercycler pro梯度PCR仪、5810R台式高速大容量冷冻离心机、BioPhotometer Plus核酸蛋白检测仪（德国Eppendorf公司）。
参考GenBank中ARF4基因序列（NM_001660.3）及pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro质粒图谱，选择Nhe I（GCTAGC）与Not I（GCGGCCGC）作为限制性内切酶设计引物，并在5'端分别加入保护碱基G和TT，上游引物序列为5'-GGCTAGCATGGGCCTCACTATCTCC-3'，下游引物序列为5'-TTGCGGCCGCTTAACGTTTTGAAAGC-3'，目的基因长度为543 bp。
图1为重组质粒构建示意图，以SKOV3 cDNA为模板扩增目的片段。PCR扩增条件：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性15 s，58 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，完成40个循环后再72 ℃延伸5 min。扩增结束后，取5 μl扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳（1%）鉴定。
目的条带电泳产物经回收、纯化后与空载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro分别进行Nhe I/Not I双酶切，用rSAP处理酶切后的空载体；然后用T4 DNA连接酶连接载体和目的基因片段，4 ℃过夜后转化大肠杆菌DH5α感受态，接种于含质量浓度为100 μg/ml氨苄青霉素的LB固体培养基上，37 ℃倒置12~16 h；挑选阳性单克隆，接种至含相同质量浓度氨苄青霉素的选择性LB液体培养基中培养，摇菌扩增后，送北京六合华大基因科技有限公司进行测序验证。
将SKOV3细胞传代至6孔板中，采用含体积分数为10%胎牛血清的RPMI-1640培养基于37 ℃、5%CO2条件下培养至细胞融合度为50%左右进行转染，转染前2 h更换为无血清RPMI-1640培养基。按LipofectamineTM 2000说明书进行转染，分别取1 g pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro/ARF4重组质粒及其空载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro（阴性对照）加至100 μl Opti-MEM培养基中，另取100 μl Opti-MEM培养基，向其中加入7.5 μl LipofectamineTM 2000，活化5 min；将两溶液混合，静置20 min；将转染体系混合物转移至SKOV3细胞培养液中，于37 ℃、5%CO2条件下培养6~10 h后更换为含体积分数为10%胎牛血清的RPMI-1640培养基继续培养48 h。
将HEK-293T细胞传代至6孔板中，采用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培基于37 ℃、5%CO2条件下培养至细胞融合度为80%左右进行转染。转染前2 h更换为无血清DMEM培基基，取3 μg混合质粒（目的质粒pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro/ARF4∶PSPAX2∶PMD2G=3∶1∶1）加至100 μl Opti-MEM培养基中，另取100 μl Opti-MEM培养基，向其中加入7.5 μl LipofectamineTM 2000，活化5 min；将两溶液混合，静置20 min；将转染体系混合物转移至HEK-293T细胞培养液中，于37 ℃、5%CO2条件下培养6~10 h后更换为含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基继续培养48 h；收集细胞上清液，400×g离心5 min，取上清经0.45 μm滤膜过滤后置于-80 ℃备用，以空白质粒处理组作为对照。
将SKOV3细胞接种于6孔板中，采用含体积分数为10%胎牛血清的RPMI-1640培养基于37 ℃、5%CO2条件下培养至细胞融合度为50%左右进行感染。按慢病毒感染增强剂EnvbirusTM-LV说明书将SKOV3细胞分别感染病毒LV-NC（对照组）和LV-ARF4（实验组），感染12~24 h后更换为含体积分数为10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，继续培养96 h。采用无限稀释法将感染病毒后的SKOV3细胞铺板于96孔板中，选用含质量浓度为1 μg/ml嘌呤霉素的RPMI-1640完全培养基筛选细胞，依次增加嘌呤霉素的质量浓度至5 μg/ml，并将未被杀死的孔中细胞不断扩增，得到具有嘌呤霉素抗性的单克隆细胞，最终得到能稳定表达ARF4的单克隆细胞系。
收集转染重组质粒或感染慢病毒的细胞，先按TRIzol说明书提取各组样品中的总RNA，然后按GoScriptTM Reverse Transcription System逆转录试剂盒说明书将RNA逆转录成cDNA，再按GoTaq qPCR Master Mix荧光定量试剂盒说明书进行实时定量PCR，反应总体系为20 μl，目的基因ARF4与内参基因GAPDH的上下游引物序列如表1所示。PCR反应条件为：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，共40个循环，并每次在延伸阶段读取吸光度（A）值。PCR结束后，95 ℃变性1 min，然后冷却至55 ℃，使DNA双链充分结合，同时读取A值制作熔解曲线。最后，采用2-ΔΔCT法计算原始CT值数据。
目的基因ARF4与内参基因GAPDH的上下游引物序列
目的基因ARF4与内参基因GAPDH的上下游引物序列
| 基因 | 上游引物（5′→3′） | 下游引物（5′→3′） |
|---|---|---|
| ARF4 | ACAGTATGGGATGTTGGTGGTCA | CAGCTCATCTGCTACTTCCTGAA |
| GAPDH | CAAGGTCATCCATGACAACTTTG | GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG |
注：ARF4—ADP核糖基化因子-4；GAPDH—甘油醛-3-磷酸脱氢酶
采用裂解液（RIPA∶PMSF=100∶1）裂解稳定过表达细胞系提取蛋白，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，并将蛋白电转移至聚偏二氟乙烯膜上；以质量浓度为50 g/L的脱脂牛奶室温振荡封闭2 h；分别加入兔抗人ARF4单克隆抗体（1∶500，21 ku）和内参小鼠抗人GAPDH单克隆抗体（1:2 000，36 ku），4 ℃孵育过夜；三羟甲基氨基甲烷缓冲液洗膜3次，每次10 min；加入对应的羊抗兔IgG和兔抗小鼠IgG，室温孵育2 h，磷酸盐吐温缓冲液洗膜3次，每次10 min；DAB显色后检测目的蛋白，采用image J图像分析软件对ARF4和GAPDH进行定量分析，以ARF4/GAPDH比值作为蛋白相对表达水平。
采用SPSS18.0统计学软件处理数据，符合正态分布的数据以均值±标准差（
±s）表示，两组间均值比较采用独立样本t检验，多组间均值比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异具有统计学意义。
提取人上皮性卵巢癌SKOV3细胞的RNA，将其逆转录为cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增ARF4基因，扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果显示，在500~600 bp之间有特异性扩增条带，与实验预期的扩增片段大小相符合。（图2）
M1—200 bp DNA梯带；M2—100 bp DNA梯带；1—ADP核糖基化因子-4
经双酶切、连接、转化后挑选单克隆菌落，并对菌落PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，其中2号菌落的PCR产物无条带出现，说明该菌落无ARF4片段插入，但1、3、4、5、6号菌落的PCR产物均在500 bp处有条带出现，而ARF4为543 bp，说明ARF4插入成功（图3）。挑选阳性条带对应的克隆进行测序，发现无移码和碱基突变，结果与预期相符，证实重组质粒插入的片段序列与ARF4的开放阅读框序列完全一致，表明人ARF4真核表达载体构建成功（图4）。
M—200 bp DNA梯带；1~6—1~6号菌落克隆的DNA PCR产物
实时定量PCR结果显示，与转染空白质粒pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro相比，重组质粒pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro/ARF4瞬时转染SKOV3细胞后ARF4 mRNA的相对表达水平明显升高，差异具有统计学意义（P<0.001）。（图5）
1—pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro；2—pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro/ARF4。与1比较，aP<0.001
收集HEK-293T细胞分泌的病毒上清液，感染SKOV3细胞构建稳定过表达细胞系，再经嘌呤霉素筛选后采用实时定量PCR和Western Blot分别检测ARF4 mRNA和蛋白的表达，结果显示，实验组SKOV3细胞中ARF4的mRNA和蛋白相对表达水平均明显高于对照组，差异均具有统计学意义（均P<0.001），表明SKOV3/ARF4稳转细胞系构建成功。（图6）
ARF4—ADP核糖基化因子-4；GAPDH—甘油醛-3-磷酸脱氢酶；对照组感染LV-NC，实验组感染LV-ARF4。与对照组比较，aP<0.001
慢病毒载体是近年来广受关注的一种逆转录病毒载体，可将外源基因有效整合到宿主染色体上，使目的基因稳定表达，从而达到良好的基因干预效果。对于一些难转染的细胞，相比传统的瞬时转染，慢病毒转染可大大提高目的基因的转染效率及其整合至宿主染色体的概率，使其较易达到稳定表达的效果，可用于后续的活体动物实验[14]。
卵巢癌是女性生殖器官常见的恶性肿瘤之一，发病率在各类妇科肿瘤中位列第三，但死亡率却高居首位，对妇女生命造成严重威胁[15]。由于卵巢的胚胎发育、组织解剖及内分泌功能较复杂，大多数卵巢癌发病隐匿，临床数据表明多数卵巢癌患者确诊时已是发生转移的晚期，而卵巢癌的侵袭生长和转移是造成患者死亡的重要原因[16]。本课题组前期研究结果发现，miR-221可靶向ARF4并抑制上皮性卵巢癌的增殖和迁移[17]，但ARF4基因在上皮性卵巢癌中的具体作用机制尚不清楚。
为探究ARF4在卵巢癌中的作用机制，本研究扩增了ARF4全长开放阅读框（共543 bp），通过凝胶电泳回收目的条带，经双酶切、纯化后与慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro进行连接，成功获得重组质粒pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro/ARF4。在脂质体介导下将重组质粒转染人上皮性卵巢癌SKOV3细胞，并用实时定量PCR验证细胞中ARF4 mRNA的相对表达水平，结果显示ARF4表达明显上调。然后将pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro/ARF4与病毒包装质粒共转染至HEK-293T细胞中，成功包装出病毒颗粒LV-ARF4。将LV-ARF4感染SKOV3细胞后分别采用实时定量PCR和Western Blot在mRNA和蛋白水平双重验证ARF4的过表达效率，证实ARF4基因的转录及翻译水平均显著上升，表明慢病毒载体及稳定转染细胞系均构建成功。
本研究成功构建了ARF4稳定表达的SKOV3细胞系，为深入研究ARF4基因在卵巢癌中的作用提供了良好的细胞模型。
无
