制备一种基于红细胞的多功能纳米载药体系，研究其体外光热及光动力效应。
通过挤出法制备吲哚菁绿（ICG）/阿霉素（DOX）共载纳米红细胞（DIRAs），并测定其形态、粒径、包封率及稳定性等参数；采用粒径电位测定仪研究其升温产气导致的粒径变化；通过红外热成像仪考察其体外光热效应；采用激光共聚焦显微镜研究乳腺癌4T1细胞对DIRAs的摄取情况；利用2'，7'-二氯荧光黄双乙酸盐（DCFH-DA）荧光探针及激光共聚焦显微镜考察光动力效应。
成功制备了DIRAs，其形态规则均匀，平均粒径（97.0±20.1）nm，Zeta电位约-21.6 mV，ICG和DOX的包封率分别为93.5%和95.2%，28 d内稳定性良好。该纳米载药体系可以产生与游离ICG相同的体外光热效应。经激光照射后，DIRAs显著增强了4T1细胞对药物的摄取，且增强了光动力效应。
制备的DIRAs纳米载药体系形态规则，粒径适宜，具有较高的包封率及光热转化效率,可增强4T1细胞对药物的摄取及光动力效应，有望用于联合光热/光动力和化疗对乳腺癌的治疗。
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乳腺癌是一种严重威胁女性生命健康的恶性肿瘤[1]。近年来，我国乳腺癌发病率显著上升，已居女性癌症发病的首位。乳腺癌的临床治疗手段包括手术、放疗、化疗和免疫治疗等[2,3]，但这些方法都存在各自的局限。光热治疗（photothermal therapy，PTT）是利用光敏剂在远程激发光源的照射下吸收光能并转换为热能，进而使肿瘤细胞升温并导致其死亡的一种新兴治疗方法[4]。该方法具有时间与空间可控，以及对周围正常组织伤害较低等优势，引起了肿瘤研究领域的广泛关注。光动力疗法（photodynamic therapy，PDT）是利用特定波长的激光激发光敏剂，并与肿瘤部位的氧作用产生大量活性氧（reactive oxygen species, ROS）进而通过直接杀伤肿瘤细胞和间接作用于肿瘤微环境（抑制肿瘤血管生成、激活肿瘤免疫等）以消除肿瘤的治疗方法[5]。PDT能选择性消灭原发与复发肿瘤，避免正常组织的损伤，该方法具有安全、微创、能缩小手术范围、改善患者愈后、可激活肿瘤免疫、减少复发等优点。
吲哚菁绿（indocyanine green，ICG）是一种具有近红外波段特征吸收的三碳花菁染料，其最大荧光发射波长范围为795~845 nm，具有较强的组织穿透能力，已被美国食品药品管理局批准用于临床生物医学成像[6,7]。ICG具有较强的PTT与PDT效率，能够吸收近红外激光并将光能高效地转换成热能，同时诱导产生大量ROS协同杀伤肿瘤，被认为是一种理想的光热/光动力治疗剂。但是，ICG的稳定性较差[8]，在血浆中能够被快速清除，从而限制了其在诊断及治疗领域的应用[9]。
近年来，采用仿生技术设计构建的基于哺乳动物细胞的纳米载体系统显示出良好的生物学性质和对肿瘤的天然靶向能力，已成为药物载体领域的研究焦点[10]。红细胞是直径为7~8 μm的无核细胞，具有良好的弹性，其体内主要生理功能为输送氧气和二氧化碳[11,12,13]。本研究利用碳酸氢铵（ammonium bicarbonate，ABC）对红细胞（red blood cell，RBC）的裂解作用，制备一种基于红细胞的仿生纳米载药体系，用于实现对ICG和化疗药物阿霉素（doxorubicin，DOX）的高效共载，以期实现联合PTT/PDT和化疗治疗乳腺癌的目的。通过挤出法制备ICG/DOX共载纳米红细胞（ICG/DOX co-loaded nanoscale RBCs，DIRAs），并对其形态、粒径、包封率及稳定性等进行表征，考察其光热效应，研究乳腺癌4T1细胞对其摄取能力以及细胞内光动力产生活性氧的情况，初步评价其在乳腺癌治疗中的应用前景。
盐酸阿霉素（DOX·HCl）(大连美仑生物技术有限公司)，ICG（北京百灵威科技有限公司），碳酸氢铵（天津科密欧化学试剂有限公司），2'，7'-二氯荧光黄双乙酸盐（2,7-dichlorodi-hydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）（美国Sigma-Aldrich公司），4',6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）（美国Thermo Fisher Scientific公司），小鼠乳腺癌4T1细胞（BiovectorNTCC细胞基因保藏中心）。
脂质体挤出仪（丹麦Avanti公司），Nano-ZS90粒度电位测定仪（英国马尔文公司），红外热成像仪（美国FLIR公司），HT7700透射电子显微镜（日本Hitachi公司）。
将4.5 mg ICG与1.5 mg DOX·HCl溶于10 ml的50 mmol/L ABC水溶液中，搅拌12 h，在冰水浴中超声5 min，得到ICG/DOX纳米复合物。根据文献[14]的方法，从BALB/c小鼠的全血中分离红细胞，计数。将上述ICG/DOX纳米复合物与3×108个红细胞混合，于冰浴中探头超声6 min，用脂质体挤出仪进行挤出，反复多次通过200 nm的聚碳酸酯膜。挤出的溶液体系以30 000 r/min于4 ℃离心30 min，重悬，得到DIRAs。另外，制备了纳米红细胞（RAs）作为对照。将3×108个红细胞加入50 mmol/L的ABC水溶液中，不加入ICG/DOX纳米复合物，其余制备方法同上，得到空白RAs。以上步骤均在避光条件下完成。
用磷钨酸将ICG/DOX纳米复合物、RAs以及DIRAs负染，用透射电镜观察纳米粒子的形态；用粒度电位测定仪考察DIRAs的粒径、粒径分布及表面电荷情况；用紫外/可见分光光度计分别于780 nm和488 nm处测定DIRAs的吸光度（A），根据标准曲线和稀释倍数计算ICG与DOX的包封率。考察DIRAs在28 d内的粒径稳定性。
分别将RAs与DIRAs进行适当稀释，利用粒径电位测定仪对样品进行加热，考察其粒径变化。
将游离ICG溶液、ICG/DOX纳米复合物以及DIRAs溶液分别用808 nm近红外激光以2.0 W/cm2的功率照射10 min（ICG的质量浓度为45 μg/ml），用红外热成像仪监测每分钟溶液温度的变化。将磷酸缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）采用相同处理作为对照。
将4T1细胞以5×104/孔的密度接种于12孔板培养24 h，分别加入PBS、游离DOX、游离ICG以及DIRAs共培养1 h。其中，不同组别中ICG溶液的质量浓度均为3 μg/ml，DOX质量浓度均为1 μg/ml。随后光照组用808 nm近红外激光以2.0 W/cm2的功率照射5 min。继续培养6 h后，用4%的多聚甲醛溶液固定，DAPI染核，于激光扫描共聚焦显微镜下观察细胞对DIRAs的摄取及定位情况。
DCFH-DA是一种活性氧荧光探针，其本身没有荧光，在穿过细胞膜进入细胞后，被细胞内的酯酶水解生成DCFH。在活性氧存在条件下，DCFH被氧化产生绿色荧光。因此，利用DCFH-DA探针，对经过不同组给药处理后的4T1细胞内的活性氧水平进行考察。将4T1细胞以1×105/孔的密度接种于12孔板上的盖玻片中培养24 h，然后分别加入游离ICG及DIRAs共培养1 h。其中，不同组别中ICG溶液质量浓度均为3 μg/ml，DOX质量浓度均为1 μg/ml。随后，光照组用808 nm近红外激光以2.0 W/cm2的功率照射5 min。继续培养12 h后，将细胞用DCFH-DA染色，DAPI染核，于激光扫描共聚焦显微镜下观察细胞活性氧产生水平。
采用SPSS10.0统计学软件处理数据，数据以均值±标准差（
±s）表示，组间数据比较采用t检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。
将ICG与DOX溶于ABC的水溶液中，经过搅拌和超声，由于ICG与DOX分子中均含有大π共轭结构，ICG与DOX之间通过π-π共轭作用，形成ICG/DOX纳米复合物（图1）。ICG/DOX纳米复合物形态呈不规则的球形（图1A），粒径为（70.0±10.2）nm（图1D），粒径分布较窄；RAs呈中空的囊泡结构，平均粒径为（102.5±20.5）nm，Zeta电位约为-22.7 mV，其中空结构为包载ICG/DOX提供了空间（图1B、图1E）；DIRAs呈清晰的膜-核结构（图1C），表明ICG/DOX被成功包载至RAs中，其平均粒径为（97.0±20.1）nm（图1F），Zeta电位约为-21.6 mV，与RAs基本一致。另外，考察了DIRAs中ICG和DOX的包封率，分别为93.5%和95.2%。28 d内DIRAs的粒径稳定，分散系数较小（图2）。
ICG—吲哚菁绿；DOX—阿霉素；DIRAs—ICG/DOX共载纳米红细胞；RAs—纳米红细胞
RAs与DIRAs体系中均含有ABC，当溶液温度上升，ABC受热分解产气。因此，需考察RAs和DIRAs体系的体外升温粒径变化。设定粒径电位测定仪参数，使样品在30 s内由25 ℃连续升温至45 ℃。如图3所示，随着温度由25 ℃升至45 ℃，RAs与DIRAs的平均粒径分别增加了62.3 nm和49.9 nm。然而，在45 ℃条件下持续加热30 s后，RAs与DIRAs体系的粒径均又降低至初始值。这可能是由于碳酸氢铵受热分解，产生的气体使体系粒径增加，而气体又可以通过纳米粒子表面包覆的细胞膜的空隙扩散至溶液中，因此粒径降低。
DIRAs—吲哚菁绿/阿霉素共载纳米红细胞；RAs—纳米红细胞
ICG具有良好的光热转换能力，因此利用红外热成像相机考察了DIRAs的体外热效应。分别将游离ICG、ICG/DOX纳米复合物以及DIRAs溶液进行激光照射，考察10 min内的温度变化情况（图4A和图4B）。结果显示，在808 nm近红外光照射下，具有相同ICG质量浓度的游离ICG、ICG/DOX纳米复合物以及DIRAs溶液温度迅速升至60 ℃，且温度变化曲线基本一致，而PBS溶液对照组的温度仅有微弱上升。由此可见，DIRAs具有较高的光热转换效率。
ICG—吲哚菁绿；DOX—阿霉素；DIRAs—ICG/DOX共载纳米红细胞；PBS—磷酸缓冲液
采用共聚焦显微镜研究4T1细胞对DIRAs的摄取。如图5所示，不同组别加药6 h后，DOX的红色荧光均定位在核里，ICG的黄色荧光均匀地分散在胞浆中。游离DOX未光照组与光照组的荧光强度并没有显著差别。而游离ICG光照组和DIRAs光照组中，ICG与DOX的荧光信号均显著增强，这说明光热效应增强了分子的热运动，促进了药物的入胞能力。另外，体系中的碳酸氢钠受热分解产气，"爆破"释药也增强了细胞对药物的摄取。
ICG—吲哚菁绿；DOX—阿霉素；DIRAs—ICG/DOX共载纳米红细胞；DIPA—4'，6-二脒基-2-苯基吲哚；L—激光照射
有研究表明，光动力产生ROS并发挥肿瘤杀伤作用的一个重要前提是氧的供给[15]。红细胞中含有丰富的血红蛋白[16]，因此血红蛋白天然的携氧功能会增强ICG的光动力效应。本研究利用DCFH-DA荧光探针考察了不同给药处理后4T1细胞中活性氧水平。如图6所示，游离ICG光照组及DIRAs光照组经光照处理，继续培养12 h后，均有较强的绿色荧光，细胞内ROS水平较高，而未光照组的荧光强度均较弱。另外，DIRAs光照组的荧光强度显著强于游离ICG光照组，证明DIRAs体系中血红蛋白携载的氧气增强了ICG的光动力效应。
ICG—吲哚菁绿；DIRAs—吲哚菁绿/阿霉素共载纳米红细胞；L—激光照射
近年来，仿生纳米载药系统成为纳米载药领域的研究热点。该类载体系统主要是以各种细胞（红细胞、免疫细胞、干细胞等）或提取的细胞膜为基础，构建纳米载体携载抗肿瘤药物，以实现药物的体内长循环和/或肿瘤靶向递送。1973年，Ihler等[17]发现破裂的红细胞在一定条件下可重封，首次将红细胞作为载体运载酶类治疗剂，开创了运用红细胞作为药物载体的先河。然而，完整的红细胞由于体积较大，不能透过生物屏障顺利到达肿瘤微环境并被肿瘤细胞所摄取。本研究中制备的红细胞载药体系具有纳米尺度上的优势，可以通过实体瘤的高通透性和滞留（enhanced permeability and retention effect, EPR）效应实现药物在肿瘤部位的蓄积。
光动力疗法包含3个主要影响因素：光、光敏剂和氧气。ICG具有较强的PTT与PDT效率，经激光照射诱导产生大量ROS实现对肿瘤细胞的杀伤。然而，实体瘤微环境通常处于乏氧状态，PDT通过耗氧导致乏氧状态进一步加剧，严重限制了PDT的肿瘤杀伤效应。因此，利用红细胞内血红蛋白的天然携氧功能来增强ICG的光动力效应。纳米红细胞载体对ICG的包载能够避免ICG与外部溶液的接触，从而提高其稳定性，还能通过有效共载ICG与其他化疗药物实现多种治疗方法的联合。
成功制备了多功能纳米红细胞载药体系，实现了光敏剂ICG和化疗药物DOX的高效共载。该纳米载药体系具有包封率高、形态规则均匀、粒径适宜和稳定性好的特点。DIRAs中ICG通过光热效应使体系升温，ABC受热分解产气，为纳米体系的可控"爆破"释药提供了基础。DIRAs可以产生与游离ICG相同的体外光热效应，且具有较高的光热转换效率。细胞摄取实验表明，激光照射ICG产生的光热效应可以促进DOX入胞，由此增强药物对肿瘤细胞的杀伤作用。红细胞中血红蛋白的天然携氧功能增强了ICG的光动力效应。综上所述，多功能纳米红细胞载药体系—DIRAs有望联合PTT/PDT和化疗实现对乳腺癌的治疗，为临床乳腺癌治疗提供理论依据和数据支持。
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