研究不同浓度葡萄糖对骨髓间充质干细胞（BMMSCs）增殖的影响。
将传代至第4~6代的BMMSCs接种培养，对照组采用DMEM/F12（1∶1）完全培养基（基础葡萄糖浓度为5.5 mmol/L）；实验组采用含不同浓度葡萄糖（20.5、25.5、30.5、35.5 mmol/L）的DMEM/F12（1∶1）高糖培养基，连续培养15 d。采用噻唑蓝（MTT）比色法分别检测每天各浓度组的吸光度（A）值。
与对照组相比，20.5 mmol/L组和30.5 mmol/L组第2、3、5天的A值升高，差异均具有统计学意义（均P<0.05）；25.5 mmol/L组第2、3、5、8天的A值升高，差异均具有统计学意义（均P<0.05）；35.5 mmol/L组第2、3、5、8天的A值升高，第4天的A值降低，差异均具有统计学意义（均P<0.05）。将20.5 mmol/L组、25.5 mmol/L组、30.5 mmol/L组和35.5 mmol/L组进一步两两比较，结果显示：35.5 mmol/L组第4、12天的A值低于20.5 mmol/L组，差异均具有统计学意义（均P<0.05）；30.5 mmol/L组和35.5 mmol/L组第11、14天的A值低于25.5 mmol/L组，差异均具有统计学意义（均P<0.05）。
高糖环境能在短期内促进BMMSCs增殖，但随着培养时间的延长，促进细胞增殖能力逐渐减弱，较高浓度葡萄糖的高糖环境会对细胞增殖产生抑制作用。
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骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs）具有多分化潜能，可分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞，发挥免疫调节作用，促进组织愈合[1,2,3]。Bertolai等[4]在上颌窦提升术中加入BMMSCs，发现移植部位骨组织重塑活跃且无炎症反应。
2013年，中国糖尿病患者达1.14亿[5]。近年来，应用干细胞引导糖尿病患者组织再生的研究非常广泛。例如在糖尿病足患者的治疗中，移植BMMSCs能促进新生血管的生成，改善肢体的血流量[6]。此外，Bell等[7]将小鼠骨髓祖细胞移植入小鼠受损胰腺，发现其能诱导内源性β细胞增殖，改善胰岛功能。然而，糖尿病的第六大并发症——糖尿病性牙周炎尚缺乏有效的治疗方式。Kawaguchi等[8,9]将BMMSCs移植入狗牙周组织，结果显示其能促进狗牙周组织再生，而将BMMSCs移植入糖尿病患者牙周组织是否能促进牙周再生尚不得而知。目前，干细胞大多是经体外培养扩增后移植入体内，关于体内高糖环境对BMMSCs增殖的影响鲜见报道，故本文旨在研究不同浓度葡萄糖对BMMSCs增殖的影响。
C57BL/6小鼠BMMSCs（货号MUBMX-01001）（美国Cyagen Biosciences公司），DMEM/F12（1∶1）培养基、胎牛血清（美国HyClone公司），青霉素-链霉素溶液（美国BI公司），胰酶（美国Gibco公司），噻唑蓝（thiazolyl blue tetrazolium bromide, MTT）粉末、D-葡萄糖（美国Sigma-Aldrich公司）。SpectraMax M3多功能酶标仪（美国Molecular Devices公司），TE2000-S倒置相差显微镜（日本Nikon公司）。
将C57BL/6小鼠BMMSCs置于37 ℃水浴箱中复苏后，加入DMEM/F12（1∶1）完全培养基[含体积分数为10%胎牛血清和100 U/ml青霉素-链霉素的DMEM/F12（1∶1）培养基]重悬细胞，按4×104个/cm2的细胞密度接种于25 cm2细胞培养瓶中，于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。每隔1天更换1次培养基，当细胞生长融合至80%~90%时，胰酶消化，然后按1∶3进行细胞传代，取第4~6代细胞用于本研究。
称取适量D-葡萄糖加至DMEM/F12（1∶1）完全培养基中，分别配制葡萄糖浓度为20.5、25.5、30.5、35.5 mmol/L的高糖培养基，经0.22 μm滤器过滤除菌备用。
将BMMSCs按5×103个/孔的密度接种于96孔板中，对照组采用DMEM/F12（1∶1）完全培养基，其基础葡萄糖浓度为5.5 mmol/L，未再加入D-葡萄糖；实验组采用配制的葡萄糖浓度分别为20.5、25.5、30.5、35.5 mmol/L的DMEM/F12（1∶1）高糖培养基；各浓度组均设4个复孔，于37 ℃、5%CO2培养箱中连续培养15 d；弃去培养基，加入磷酸盐缓冲液洗1次；每孔加入20 μl质量浓度为0.5 mg/ml的MTT溶液，继续孵育4 h；吸弃悬液，每孔加入150 μl二甲基亚砜，避光振荡10 min后采用多功能酶标仪测定490 nm处的吸光度（A）值。
采用SPSS22.0统计学软件处理数据，符合正态分布的计量资料以均值±标准差（
±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，多重比较采用最小显著性差异（LSD）-t检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。
BMMSCs复苏后贴壁生长，形态为长梭形，呈旋涡状均匀生长（图1）。BMMSCs生长速度较快，4~5 d传代1次，当细胞生长融合至80%~90%时，按1∶3进行传代。6代以内BMMSCs的生长速度及细胞形态均无改变。
采用不同浓度葡萄糖的DMEM/F12（1∶1）培养基对BMMSCs连续培养15 d，MTT比色法分别检测每天各浓度组的A值。检测结果显示：与5.5 mmol/L组（对照组）相比，20.5 mmol/L组和30.5 mmol/L组第2、3、5天的A值升高，差异均具有统计学意义（均P<0.05）；25.5 mmol/L组第2、3、5、8天的A值升高，差异均具有统计学意义（均P<0.05）；35.5 mmol/L组第2、3、5、8天的A值升高，第4天的A值降低，差异均具有统计学意义（均P<0.05）。将20.5 mmol/L组、25.5 mmol/L组、30.5 mmol/L组和35.5 mmol/L组进一步两两比较，结果显示：35.5 mmol/L组第4、12天的A值低于20.5 mmol/L组，差异均具有统计学意义（均P<0.05）；30.5 mmol/L组和35.5 mmol/L组第11、14天的A值低于25.5 mmol/L组，差异均具有统计学意义（均P<0.05）。上述结果表明，高糖环境能在短期内促进BMMSCs增殖，但随着培养时间的延长，促进细胞增殖能力逐渐减弱，较高浓度葡萄糖的高糖环境会对细胞增殖产生抑制作用。（图2）
与相同培养时间的5.5 mmol/L组（对照组）比较，aP<0.05；与相同培养时间的35.5 mmol/L组比较，bP<0.05；与相同培养时间的25.5 mmol/L组比较，cP<0.05
糖尿病是一组以高血糖为特征的代谢性疾病，其并发症严重危害着糖尿病患者的身体健康，并影响着患者的生存质量。例如糖尿病性牙周炎会严重破坏患者的牙周组织，而患者体内的高糖环境极不利于组织的修复，因此急需新的治疗方式来解决这一问题。近年来的研究结果发现，干细胞缺乏主要组织相容性复合体Ⅱ类分子，具有低免疫原性及归巢特性，已广泛用于1型糖尿病的治疗研究[10]。
在干细胞移植治疗实验过程中，有时干细胞无法达到炎症组织部位。研究结果表明，增殖能力会影响自体干细胞移植后的创伤愈合程度[11]。因此，有必要确定哪些因素会影响糖尿病患者的自体干细胞移植，从而探讨如何进行改良以提高干细胞的移植效率[12]。本研究旨在评价BMMSCs移植入糖尿病患者体内后，高糖环境对其增殖的影响。文献报道，高糖环境能抑制BMMSCs增殖[11]、增加细胞凋亡[12,13]、促进细胞衰老[13]。同时，BMMSCs的增殖和分化能力还受年龄因素影响[14]。然而Li等[15]认为，高糖环境不仅对20代以内BMMSCs的增殖几乎无影响，还能长期促进端粒酶永生化人间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）的增殖，且不影响其凋亡；Weil等[16]也报道称，体外高糖环境对人MSCs的增殖无影响，可能是由于MSCs能耐受短期内高糖的作用。这与本研究的结果部分类似，可能是由于细胞的主要能量来源于葡萄糖，而体外培养的细胞与体内细胞代谢不同，可能消耗更多能量，因此随着培养时间的延长，细胞逐渐衰老，代谢缓慢，能量消耗减少，较高浓度的高糖溶液对细胞增殖产生了抑制作用。
然而，BMMSCs移植还存在一些问题。有研究者证实，MSCs经体外扩增培养后会逐渐丧失多分化潜能，倾向于成骨分化[17,18,19]。Dhanasekaran等[20]提出15代以内的BMMSCs仍能保持多分化特性，这与培养基有很大关系，他们认为体外培养的最佳培养基为DMEM低糖培养基，但也指出DMEM/F12（1∶1）培养基也能在体外使15代以内的BMMSCs维持多分化特性。本研究采用的是第4~6代BMMSCs，选取了DMEM/F12（1∶1）培养基，因其与DMEM低糖培养基的基础葡萄糖浓度一致，故对本研究结果的影响相对较小。
此外，在体外长期培养条件下，高糖环境对BMMSCs分化和表面标志物表达的影响亦未知。李茜等[21]提出高糖对BMMSCs的分化具有促进作用，但糖尿病患者体内并非单纯的高糖环境，如2型糖尿病患者体内的糖、脂、氨基酸代谢及激素水平均不正常，大多有高糖和高脂血症[22]。因此，需要在体外模拟糖尿病患者的体内状态，以进一步考察高糖和高脂肪酸状态对BMMSCs增殖和凋亡的影响。此外，糖尿病环境下BMMSCs是否存在功能缺陷、是否能自体移植治疗糖尿病及其并发症，还需开展进一步的研究。
本研究结果显示，高糖环境能在短期内促进BMMSCs增殖，但随着培养时间的延长，较高浓度葡萄糖的高糖环境会对细胞增殖产生抑制作用。该结果表明，较低浓度葡萄糖的高糖环境非但未抑制BMMSCs增殖，反而促进其增殖，提示高糖环境不是抑制BMMSCs的主要因素，但需控制高糖浓度，否则随着培养时间的延长，较高浓度葡萄糖的高糖环境下会出现细胞增殖下降。
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