制备集他克莫司（FK506）免疫抑制和人工泪液羧甲基纤维素钠（CMC）润滑双功能于一体的纳米药物，为临床治疗干眼症提供依据。
首先采用超声法制备FK506纳米晶，进而利用层层自组装（LbL）技术将聚烯丙基胺盐酸盐（PAH）和CMC逐层交替沉积于FK506纳米晶表面，制备双功能纳米药物，并对其形态、粒径、表面电荷及组分等进行分析。
FK506纳米晶粒径均一，FK506-（PAH/CMC）3近似球形，且表面凹凸不平。Zeta电位检测结果显示，LbL过程中随着包被层数的增加，Zeta电位呈正负交替变化，结合激光扫描共聚焦成像以及红外光谱等结果证实，PAH和CMC已成功修饰于FK506纳米晶表面。
制备的FK506-（PAH/CMC）3纳米药物有望为联合治疗干眼症提供科学依据。
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近年来，电子产品尤其是智能手机的普及使人们的生活习惯发生了很大改变，加之所居环境大气污染等因素，导致干眼症的发病率呈逐年上升趋势。临床上治疗干眼症的药物主要有人工泪液、抗炎药物、自体血清等，较重度的干眼症患者则需行泪点栓塞甚至手术治疗[1]。羧甲基纤维素钠（sodium carboxymethyl cellulose, CMC）作为一种人工泪液，因其价格低廉及易获取而成为目前治疗干眼症的常用药物。
然而新近的一项研究结果显示，在干眼症患者的泪腺中有淋巴细胞的炎症浸润，眼表亦有炎症因子的表达，泪腺和眼表均表现为CD4+ T为主的淋巴细胞浸润[2]。经治疗后，眼表的炎症标志物表达明显降低，杯状细胞密度明显增加，表明免疫炎症在干眼症中起主导作用[3]。因此，临床认为干眼症属于一种非感染性的免疫性炎症[4]。目前，临床上单独使用CMC治疗干眼症效果有限，而将其联合免疫抑制剂协同治疗干眼症有望取得更好的治疗效果。
环孢霉素A是第一代免疫抑制剂，常用于治疗眼表免疫炎症[5]。他克莫司（tacrolimus，FK506）属于新型免疫抑制剂，是23元大环内酯类抗生素，效力比环孢霉素A高30~100倍[6,7]；但其不易溶于水，在眼表的生物利用度不高，限制了其在临床上的应用。随着材料学和药剂学的发展，采用脂质体、聚乳酸纳米粒子、白蛋白纳米粒子以及聚乳酸-羟基乙酸共聚物棒状植入物等负载FK506，有效克服了FK506溶解性差及生物利用度低的不足[8,9,10,11]。然而，直接利用FK506纳米晶原料药的物理性质、减小纳米晶粒径并使其具备缓释功能的研究鲜见报道。同时，临床上发现直接滴加FK506滴眼液会对干眼症患者眼表组织产生一定的刺激性，使患者出现眼磨、异物感等症状。人工泪液具有润湿眼表、维持泪膜稳定性的作用，将其修饰于FK506晶体表面，既可降低对眼表组织的刺激，又可延长药物的作用时间，减少给药次数，提高药效和患者依从性。
层层自组装（layer-by-layer self-assembly，LbL）技术是一种简便的材料表面修饰方法，其最初原理是利用带相反电荷的聚电解质交替沉积而对材料进行表面改性。LbL技术因其简单和通用的特点在药物递送系统得到了快速推广，尤其在载体表面修饰以及聚电解质微囊、纳米囊合成等方面受到了广泛关注[12,13,14]。以药物晶体为模板在其表面沉积聚电解质，不仅避免了微囊类药物载体合成过程中的去除模板步骤，还可减少传统药物递送系统药物负载过程中的原料药损失，提高了药物利用率[15]。因此，本研究拟通过超声方法首先获得FK506纳米晶，进而利用LbL技术在FK506纳米晶表面修饰人工泪液CMC，从而既达到缓释FK506的作用，又将润滑功能和免疫抑制联合用于干眼症的治疗。
FK506（湖北远成赛创科技有限公司），CMC、聚烯丙基胺盐酸盐[poly（allylamine hydrochloride），PAH]（美国Sigma公司）。
Centrifuge 5418离心机（德国Eppendorf公司），GOLD-SLM冷冻干燥机（美国SIM公司），LSM710激光扫描共聚焦显微镜、SUPRA55VP扫描电子显微镜（德国Carl Zeiss公司），UH-S2超声波细胞粉碎机（美国Autoscience Instrument公司），Tecnai-F20透射电子显微镜（荷兰FEI公司），Nano-ZS90粒度分析仪（英国Malvern仪器有限公司），Nicolet iS10傅里叶变换红外光谱仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）。
精密称取40 mg FK506溶于10 ml Milli-Q超纯水中，在冰浴条件下超声处理不同时间，其中超声功率为400 W，超声2 s，间隔2 s。超声后用800目细胞筛分离优化产物，4 ℃保存。
称取4 mg FK506纳米晶冻干粉置于1.5 ml离心管内，加入质量浓度为2 mg/ml的PAH溶液（溶剂为0.5 mol/L的NaCl溶液），旋转孵育30 min，离心并用NaCl溶液洗涤3次，除去过量的PAH；再向修饰了一层PAH的FK506纳米晶中加入质量浓度为2 mg/ml的CMC溶液（溶剂为0.5 mol/L的NaCl溶液），混悬30 min后离心，用NaCl溶液洗涤3次，除去过量的CMC，完成纳米晶表面的第一个双层复合材料（PAH/CMC）修饰。交替重复以上过程2次，最终得到修饰了3个双层复合材料的FK506纳米晶复合物FK506-（PAH/CMC）3。将纳米晶复合物分散于体积分数为2%的戊二醛溶液中混旋1 h进行交联，然后立即离心加入30 mmol/L NaBH4溶液混旋30 min终止交联，离心，Milli-Q超纯水洗涤3次，4 ℃保存。
将FK506纳米晶混悬液滴至预先处理过的硅片上自然晾干，喷金后于扫描电子显微镜下进行观察。将FK506-（PAH/CMC）3纳米晶混悬液滴至铜网上，室温下自然晾干后于透射电子显微镜下进行观察。利用异硫氰酸荧光素标记的PAH作为最外层组装于FK506纳米晶表面，避光处理后于激光扫描共聚焦显微镜下进行观察。
用去离子水将LbL过程中每次修饰聚电解质材料后的FK506纳米晶稀释40倍，用粒度分析仪测定纳米晶表面电荷在LbL过程中的变化，每组数据测3次，取平均值。
称取适量已冻干的FK506-PAH/CMC纳米晶粉末及FK506、PAH、CMC原料，分别与KBr粉末以1∶100（质量比）混合压片，用傅里叶变换红外光谱仪测定各样品的红外光谱图。
扫描电子显微镜观察可见，FK506原料药的形状不规则、尺寸不均一，粒径为（13.89±0.74）μm（图1A）；当超声12 min后，FK506微晶的粒径减小至（1.80±0.30）μm，分散性有所提高（图1B）；当超声24 min后，微晶的粒径减小至（0.92±0.14）μm（图1C）；进一步延长超声时间至32 min时，微晶的粒径减小至（0.61±0.11）μm（图1D）；将FK506超声24 min后再经800目细胞筛过滤筛选，所得微晶大小更为均一，形成了分散性良好的FK506纳米晶（图1E）。由此可见，随着超声时间的延长，FK506微晶更趋于球形，且形态趋于均一。
利用Nanomeasure软件统计发现，随着超声时间的延长，FK506晶体的粒径呈逐渐减小趋势，但超声24 min后，粒径变化不再明显（图2A）；而FK506晶体的长径比随着超声时间的延长逐渐降低至趋于1（图2B），这与扫描电子显微镜结果一致。
图3A，图3B，图3C为FK506超声20 min后经LbL制备的FK506-（PAH/CMC）3的透射电子显微镜图。由图3A可以看出，FK506超声后的尺寸不均，原料药的直径约13 μm；图3B显示，较大粒径的FK506纳米晶经800目细胞筛过滤筛选后，粒径约900 nm，同时可见FK506纳米晶表面包被了多层CMC；图3C显示，高倍镜下FK506-（PAH/CMC）3纳米晶近似球形，且表面呈凹凸不平结构。图3D为FK506-（PAH/CMC）3纳米晶的激光扫描共聚焦显微镜图，可见异硫氰酸荧光素标记的PAH已成功修饰于CMC包被的FK506纳米晶表面。
FK506—他克莫司；PAH—聚烯丙基胺盐酸盐；CMC—羧甲基纤维素钠
测定结果显示，FK506纳米晶的Zeta电位为-9.8 mV；PAH吸附后，Zeta电位上升至35.9 mV；进一步沉积CMC后，Zeta电位下降至-28.4 mV；逐层交替沉积3个双层聚电解质的过程中，FK506纳米晶的Zeta电位呈正负交替变化，表明CMC已修饰于FK506纳米晶表面，且其组装过程为静电力驱动。（图4）
FK506—他克莫司；PAH—聚烯丙基胺盐酸盐；CMC—羧甲基纤维素钠
FK506原料药的红外光谱图中，3 461 cm-1为O—H伸缩振动峰，1 742 cm-1为C=O伸缩振动峰，1 641 cm-1为C=C骨架振动峰，997 cm-1和928 cm-1为末端烯键的面内弯曲振动峰，1 450 cm-1为酰胺C—N伸缩振动峰。PAH的傅里叶变换红外光谱图中，3 421 cm-1为N—H伸缩振动峰，3 011 cm-1为NH3+伸缩振动峰，1 508 cm-1为N—H变形振动峰。CMC的红外光谱图中，3 284 cm-1为O—H特征峰，1 602 cm-1和1 421 cm-1为COO—对称与不对称振动吸收峰[16]。FK506-PAH/CMC的红外光谱图中，1 641 cm-1为FK506的特征C=C骨架振动峰，说明样品中含有FK506组分；1 519 cm-1、1 608 cm-1和1 412 cm-1处的弱峰表明PAH和CMC已成功修饰于FK506纳米晶表面，但两者含量较低。（图5）
1—他克莫司；2—聚烯丙基胺盐酸盐；3—羧甲基纤维素钠；4—他克莫司-聚烯丙基胺盐酸盐/羧甲基纤维素钠纳米晶
FK506为疏水性药物，存在溶解性差和生物利用度低等不足，且已有关于FK506滴眼液临床不良反应的报道。近年来，利用聚合物微/纳米粒子载药实现药物缓释及靶向递送的研究备受关注[17]，然而低包封率造成的原药损失、药物晶型改变以及辅料生物安全性一直制约着新制剂的临床转化。CMC是一种常用的人工泪液，其效果良好且理化性质稳定。因此，笔者通过合理设计将临床眼科常用药CMC和FK506有机结合，采用超声方法获得了粒径均一的FK506纳米晶，并进一步利用CMC对FK506纳米晶进行了表面修饰，既降低了原药负载损失，又利用CMC增强了眼表黏附性及FK506的免疫抑制性，以发挥协同给药优势。本研究不仅在药物缓释系统构建方面具有启发意义，还为临床治疗免疫性干眼症提供了新思路，对解决临床干眼症对症药品匮乏问题亦具有重要的实际应用价值。
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