细胞凋亡包含多种信号通路途径，其中内在信号通路为线粒体凋亡途径，是由信号分子引起Bax等促凋亡因子活化转移至线粒体外膜形成蛋白性孔道，改变线粒体膜通透性，释放细胞色素C，激活下游caspase-9而诱导凋亡起始。针对相应使用小分子起始凋亡研究Bax结构在凋亡中结构的具体变化，结果发现，Bax蛋白结构C端S184附近有一疏水口袋结构，可结合某些小分子物质特异性去除磷酸化S184，调节Bax蛋白促进凋亡活性。目前，Bax蛋白核磁结构已获得，晶体结构未见。其与Bcl-2家族中其他蛋白形成共晶结构已有析出，可用于研究蛋白间的相互作用，了解凋亡时异源二聚体形成中具体结构、位点等的变化。旨在通过Bax核磁结构解析Bax蛋白，得到诱导细胞凋亡中位点变化从而促进凋亡起始。
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Bax是线粒体凋亡途径中一种关键蛋白。在凋亡信号刺激下，Bax单体从胞浆转位到线粒体膜表面并插入线粒体膜上聚集形成低聚物。该低聚物可激发线粒体膜通透性使线粒体外膜透化，释放细胞色素C，激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9（cysteine proteinase-9，caspase-9）启动caspase凋亡通路，从而诱发凋亡（图1[1]）。Bax包括9个α螺旋，有同凋亡抑制蛋白——Bcl-xL蛋白结构相似的α1-α8螺旋，其中在羧基端的α9螺旋有疏水口袋结构，此螺旋结构被预测为有调停作用。当Bcl-2家族中抑制凋亡成员如Bcl-2与Bax形成异二聚体时，Bax生物活性的功能可能是被α9螺旋支配发挥作用[2]。通过对Bax蛋白结构进行分析可知蛋白具体作用位点，多种研究结果表明，Bax多与Bcl-2家族其他成员共晶表达，通过共晶解析内部螺旋位点变化。本文从Bax基因层面、蛋白相互作用层面、蛋白晶体结构解析、Bax蛋白其家族蛋白共晶结构层面得到蛋白起功能作用位点以及蛋白相互作用等情况。蛋白结构解析中，通过多结构比对、蛋白螺旋线方向变化、螺旋角形成等情况分析凋亡过程以及蛋白分子互作中具体结构变化。
1993年，有研究者首先在白细胞介素-3（IL-3）依赖细胞凋亡途径中发现了Bax基因表达的蛋白。Bax是Bcl-2家族中的一员，该家族蛋白表达具有高度同源性。Bax是最早发现的促凋亡因子，有21%的氨基酸与Bcl-2同源[3]。Bax基因定位于染色体19q13.3~19q13.4，有6个外显子。按mRNA剪接方式的不同，Bax-mRNA分为α、β、δ、γ、σ、ξ 6种亚型[4]。通常Bax蛋白即指Bax-α，由192个氨基酸残基组成，相对分子质量为21 ku[5]。其含有BH1、BH2和BH3结构域，不含Bcl-2家族中的BH4结构域。Bax蛋白在细胞内膜、细胞浆和细胞核等处均有分布，只有收到信号刺激才从胞浆中转移至线粒体膜[1]。Bcl-2一般存在于线粒体外膜上，主要负责定位和插入线粒体外膜，抑制细胞凋亡，其表达可对抗细胞内外的自由基引起的氧化损伤。Bcl-2可竞争性地结合Bax蛋白，当Bax同Bcl-2形成异源二聚体时，Bax同源二聚体的形成减少，拮抗性抑制凋亡发生[6]。当Bax和Bcl-2处于动态平衡时，细胞正常存活。因此，有研究者将Bax和Bcl-2的比值称为"凋亡开关"。虽然其蛋白相互作用已被研究，但具体关于Bax如何迁移到线粒体位置及其相关磷酸化还不是特别明确。有研究结果表明，Bax在迁移中与Bcl-xL分子相互作用，Bcl-xL确实能重新定位Bax从线粒体到胞质并起作用[7]，但相应的Bcl-xL△C缺乏此能力[8,9]及刺激Bax活化能力[10]。
最新研究结果表明，一个新通路可以激活Bax，可独立于促凋亡蛋白BH3，通过在脂质体中利用5个小分子催化剂（OICR766A、Ebselen、PMA、Plumbagin、ZM）激活Bax[11]。利用细胞培养方法使脂质体透化，通过线粒体分离和渗透分析等处理，再利用多种分析或成像方法检验，表明Bax可激活多种机制。推测小分子可激活Bax，该激活机制能对细胞信号做出反应，药物中毒协同/单独作用，该方法独立于BH3蛋白质产生代谢产物。同时表明，某些细胞中的Bax和Bak可以在没有BH3蛋白调节情况下被激活。
Bax结构中一个有趣的角色为丝氨酸184（S184），其是极少有位于α螺旋上的疏水残基，当删除S184（△S184），α9转换成有意义的锚定膜蛋白可驱动Bax并定位在线粒体上。因此，△S184可阻止Bax从线粒体的外膜转位酶复合结构部分向线粒体迁移[12]。已经确定，S184可被不同激酶磷酸化，如蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）[13,14]和磷脂肌醇信号途径（PKCζ）[15]。其中相关联的有AKT。AKT，一个相对分子质量为60 ku的丝氨酸/苏氨酸激酶，可在多种细胞类型中表达，已有研究结果表明，其可以抑制自发和刺激诱导的中性粒细胞的凋亡。有活性的AKT可通过多种方式抑制凋亡，如上调或下调Bax对线粒体的作用。AKT可以调节蛋白之间相互作用（Bax和Bcl-xL分子互作），如Bcl-2家族成员中的促凋亡Bad磷酸化，或一些转录因子等[16]。研究结果表明，在酵母细胞中共表达人类Bax和AKT，发现AKT可以增加细胞和线粒体内Bax容量，同时提高了Bax释放细胞色素C的能力，即由抑制凋亡转变为促凋亡[17]。
在人源肺癌细胞中用尼古丁诱导S184磷酸化，使Bax促凋亡功能失活，增加肺癌细胞的耐药性。反之，蛋白磷酸酶2A（protein phosphatase 2A，PP2A）对Bax起磷酸化作用，但实际对S184起脱磷酸作用，PP2A使已磷酸化激活的蛋白脱磷酸，从而细胞凋亡。以上结果表明，S184磷酸化位点调节Bax蛋白的促凋亡活性[18]。
Bax结构中包含9个α螺旋，Bax蛋白折叠近似于Bcl-xL的8个两亲性质的α螺旋聚集在一个疏水α螺旋中心（α5）。Bax相关的球形数据表明，Bax以单体形式表现出不断变化，其蛋白大小特点相当于二级结构，以平均值15NT2为对比。骨架15N{1H}-NOE和15NT2可用来鉴定蛋白活性区域。当15N{1H}-NOE降低及15NT2标志增加时，表明N端12残基高度易变。结构中大型回路定位在α1和α2之间，Bcl-xL和Bid同样表现为除中心区域外其他结构是多变的。结构骨架松弛率在中心残基接近于分子中精确部分的均值。此外，在残基中心和IIe133中间的NOEs被观察到不稳定，就像在α6中的Met137。以上均表明，在一段时间内，这个环状的中心部分接触部分球形蛋白。该环状结构的动态概况近似于Bcl-xL中相应结构（残基Lys21-Met83）。在Bcl-xL中，Ala50和Ala60残基区域间15N{1H}-NOE表达量虽不高，但却高于环状结构中剩余残基的平均值[19]，表明其可移动的概率很小。通过骨架动力学方面研究，与之相似的变种人免疫缺陷病毒-1（human immunodeficiency virus-1，HIV-1）蛋白Nef的N端长链同样表明，HIV-1蛋白酶裂解位点移动最先受限，随之表明其内部有高度移动区域[20]。移动中的中心受限区对比长链，发现在Bid整圈中有相同的移动[21]。在Bid（图2[22]）中的这个环包括切割caspases的位点从而活化促凋亡蛋白[22,23]。Bax螺旋α8和α9间短环链被溶解暴露，两个残基（Thr167，Thr169）的酰胺质子在溶解中迅速交换显示并不显著。其上有3个可活动区域长度，N端尾部（Bax尾端15个残基，Bcl-xL中3个残基），长环链的α1和α2间（Bax的18个残基，Bcl-xL的63个残基）、环α8和α9间（Bax的5个残基，Bcl-xL的18个残基）均表明Bax和Bcl-xL是不同的。
Bax和Bcl-xL的其他结构几乎相同。对比Bax同Bcl-xL成对骨架螺旋，经计算，Bcl-xL结构与Bax对应有相同8个螺旋，而没有α9螺旋。Bcl-2家族中Bid同样包含8个螺旋。然而，相似的Bax与Bid间或Bcl-xL与Bid都很难识别，通过使用成对均方根转换值计算进一步排除，在Bid中α8不存在。高度相似的Bax和Bcl-xL结构，对比氨基酸序列的同一性百分度较低（20%），主要聚集在3个结构域：BH1、BH2和BH3。Bcl-xL的BH4区域包含α1螺旋。在Bax中同样有相似的螺旋，但在氨基酸序列中BH4结构域并不存在。尽管Bax的α1螺旋线有3个氨基酸残基长度。Bax和Bcl-xL蛋白残基中关于α1螺旋的相对取向是相同的，研究结果表明，Bax的α1螺旋部分残基在凋亡前隐藏在其内部，起始凋亡后开始插入到膜上，可见凋亡中α1螺旋结构暴露。Bax和Bcl-xL二者区别在α2、α3和α4比较明显，在Bcl-xL的这些螺旋周围有疏水口袋。在Bcl-2家族成员中，α2螺旋包含于BH3结构域，被看作是一个重要的相互作用功能域。此螺旋在Bcl-xL和Bcl-xL-Bak多肽中被包装接近蛋白疏水中心，而在Bax中则稍远一些。同时，这一螺旋与Bcl-xL-多肽复合物相比只是Bcl-xL或Bax结构多了6个氨基酸残基。α3螺旋在Bcl-xL中转移朝向疏水口袋结构，与Bax比较，Bcl-xL-Bak复合物中此螺旋Bax和Bcl-xL少了3个氨基酸残基。同样定位Bcl-xL中的α4螺旋也不同于Bax。α4和中心疏水区α5间的螺旋角在Bax中为11°，在Bcl-xL中为39°，在Bcl-xL-Bak多肽复合物中为24°。BH1结构域连接α4和α5。Bax、Bcl-xL和Bcl-xL中的其他螺旋结构α5、α6、α7和α8螺旋取向同长度都非常相似。α7和α8构成保守的BH2结构域。
Bax的C端疏水区是假定的跨膜域，C端一部分结构形成α9螺旋。Bax中的α9螺旋定位在疏水口袋结构，尽管多肽定位方向与Bax的C端螺旋方向相反，但其方式与Bak BH3多肽结合到Bcl-xL上类似。删除Bcl-xL的C端24个残基，减少这部分的结构后蛋白疏水口袋结构暴露。改变Bcl-xL的α2、α3、α4螺旋可以解释部分蛋白疏水口袋结构暴露减少的情况。缩短Bak多肽或缺少部分结构无法阻止α2、α3、α4螺旋在包装中靠近中心区。在Bax中，长链C端螺旋定义这些螺旋线方向和包装情况。Bcl-xL这些疏水口袋结合Bak多肽上BH3结构域，已表明该位点在抗凋亡性Bcl-xL和相对应的促凋亡BH3结构域之间可形成二聚体[2]。
BH3-only protein Bim是直接作用于Bax蛋白强有力的蛋白激活剂[24]，但其活性的结构基础尚不明确。有研究者发现，BimBH3:Bax△C26形成共晶结构，相似的BidBH3:Bax△C21复合结构结合在Bax同源表面保守疏水结构BH3中残基"h1-h4"。然而，结构和突变数据表明，Bim同Bid相比，其不依赖于"h0"残基去激活Bax，类似BidBH3结构和BaxBH3结合到Bax△C21，BimBH3:Bax△C复合结构中Baxα1、α2、α5和α8螺旋可形成一个空腔结构。
BimBH3:Bax△C26晶体结构分析如图3[8]所示，同时对比BidBH3:Bax△C21结构，发现BimBH3:Bax△C26晶体结构显示一个一分为二的核心/锁扣二聚体，即核心（α2-α5）和锁扣（α6-α8）两结构域，BimBH3肽呈现不对称结构，Bax△C21与BaxBH3和BidBH3形成的复合物结构相似。Bax中残基10-128与球形实体保持一致，Bim肽和Bax残基中129-166合作多肽核心/锁扣二聚体结构与BidBH3:Bax△C21中二聚体结构类似，说明BidBH3肽参与Bax△C肽绑定结合槽，并且Bax△C这一结构在两种复杂结构中几乎相同。然而，在Bax的蛋白质核心中，F30在这两个复合体中显示出不同的构象。在BimBH3复合体中，它的苯基环有增高的B因子。BimBH3复合结构中未建模的电子密度比邻于F30，其异常现象可能是由两种复合物使用不同结晶条件导致，而不是因为Bim和Bid的BH3序列不同导致。Bax△26（G166）C端末端结合载体上残基（丝氨酸）时是可见的，而BidBH3:Bax△C21C端残基168-171则是无序结构。虽然Bim和Bid肽长度不同，但其结构中"h0-h4"残基构成的螺旋片段是非常接近的。
在BidBH3中的丙氨酸"h0"位置替换（I82/I83）取消了在表面等离子体共振化验中绑定Bax△C21能力并且渗透脂质体暴露全长Bax[25]。对比复合结构BimBH3:Bax△C26和BidBH3:Bax△C21，确定了肽-蛋白质之间的相互作用，其显著结构差异在"h2+1"、Bim中R153和Bid中A91。在BimBH3复合结构中，Bim R153形成一个平面堆栈,通过Bim D157、Bax R109和Bax D102形成相互作用网络。Bim R153同样以氢键连接Bax S101、支柱羰基Bax D97和M98；而在BidBH3复合结构中，A91不能形成类似的互作[26]。
随着生命科学的发展，主要研究对象为功能基因组学，包括结构基因组和蛋白质组等研究。其从DNA、mRNA及蛋白质3个层次进行调控，即转录水平调控、翻译水平调控及翻译后水平调控。研究结果表明，组织中mRNA丰度和蛋白质丰度相关性并不好，尤其对低丰度蛋白质来说相关性更差。更为重要的是，蛋白质复杂的翻译后修饰、蛋白质的亚细胞定位和迁移、蛋白质-蛋白质相互作用等几乎无法从mRNA水平判断。其中对蛋白质则具体研究其结构——蛋白质晶体学研究。
蛋白质晶体学是以多个学科的发展为基础而发展起来的，如分子生物学、蛋白质组学、生物物理学、计算机科学和数学的发展，是以蛋白质的三维结构和生物功能为研究对象的一门综合性学科。借助蛋白结合形成共晶结构，通过多种研究方法的耦合将对无论单晶体表达或共晶结构观察蛋白互作等均对研究蛋白中相互作用起到实质性帮助。
本文所叙述的Bax蛋白，通过Bax核磁结构解析Bax蛋白，利用相关蛋白相互作用得到分子互作中具体位点变化情况，得知诱导细胞凋亡中位点变化，从而促进凋亡起始。利用结构变化，可通过小药物分子库搜得小分子药物、起始或抑制凋亡发生以及其他生物化学等反应。由于Bax氨基酸相对分子质量比较小，更易研究核磁结构，但其晶体结构易被多种条件影响，不能很好地得到晶体，其晶体培养较为困难。目前大多为Bax与其家族蛋白共表达形成共晶结构并被不断解析，为蛋白互作提供了多种帮助，为Bax形成单晶结构提供了多种可能。
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