在与传染性疾病的抗争过程中，人们研发出了许多有效的疫苗，由最初的灭活疫苗、减毒活疫苗等传统疫苗发展到亚单位疫苗、合成肽疫苗、基因工程疫苗等新型疫苗。在这些新型疫苗的研发中，往往会遇到抗原免疫原性弱、不良反应大、引起的免疫应答强度不够、储存稳定性差等问题，由此需要研发相应的佐剂来解决这些问题。

佐剂是疫苗的重要组成部分，其通过调节或增强机体对抗原的免疫应答来提高疫苗的效力，同时能减少抗原用量，提高疫苗的安全性。佐剂能激活抗原提呈细胞（antigen presenting cells，APCs），促进APCs对抗原的摄取，刺激不同细胞因子和趋化因子的分泌，使CD4⁺ T细胞分化为不同类型（Th1、Th2、Th17等）的细胞，从而引起下游的特异性免疫应答。佐剂的作用机制虽未彻底弄清，但研究人员发现佐剂主要通过诱导固有免疫反应发挥作用。一些佐剂如单磷酰脂质A（monophosphoryl lipid A，MPL）、CpG寡脱氧核苷酸（CpG oligodeoxynucleotides，CpG-ODN）、聚肌苷酸聚胞苷酸（polyinosinic acid-polycytidylic acid，Poly I:C）等Toll样受体（Toll-like receptors，TLRs）激动剂，它们发挥作用的模式类似于病原体相关分子模式，与模式识别受体（pattern recognition receptors，PRRs）结合后激活固有免疫细胞。PRRs主要由固有免疫细胞表达，如树突状细胞、巨噬细胞、单核细胞等。PRRs主要包括TLRs、NOD样受体、RIG-I样受体和C型凝集素受体。

一般认为，Th1型免疫反应清除细胞内病原体（如结核分枝杆菌），Th2型免疫反应清除细胞外病原体（如寄生虫）。由于不同佐剂发挥作用的机制不尽相同，为设计出更安全有效的疫苗，人们尝试将两种或两种以上的佐剂联合应用，期望通过激活一系列免疫细胞和多种免疫机制以诱导某种特定类型的免疫反应或使其发挥叠加/协同效应。如葛兰素史克公司研发的AS04联合了仅产生Th2型免疫反应的铝佐剂和能促进γ-干扰素（interferon-γ，IFN-γ）产生、引起Th1型免疫反应的MPL。对于免疫系统功能下降的老年人、免疫系统发育不全的婴幼儿、患有慢性疾病的个体等传染病易感人群而言，他们对传统疫苗的免疫反应下降，更需要佐剂的辅助来提高疫苗效力。本文将对一些已被批准应用或正在研发中的新型佐剂以及一些佐剂联合应用的最新进展进行综述，主要包括阳离子脂质体、免疫刺激复合物（immunostimulating complexes，ISCOMs）、Montanide油佐剂、聚阳离子肽IC31、纳米乳佐剂和AS佐剂系统等，论述它们在临床前和临床试验中的应用效果。

阳离子脂质体作为抗原递送载体，可在注射局部形成抗原储库，保护负载的抗原不被降解；阳离子脂质体表面带有正电荷，可促进抗原递送至APCs。另外，阳离子脂质体本身具有一定的免疫调节剂的特性，可刺激机体产生较强的细胞和体液免疫反应。脂质体的种类、粒径、表面电荷及双分子层的流动性等均会影响脂质体作为疫苗佐剂的效力^[1]。目前，常用的阳离子脂质体佐剂主要包括双十八烷基二甲基溴化铵（dimethyldioctadecylammonium bromide，DDA）、3-[N-（N'，N'-二甲基氨基乙基）-氨基甲酰基]胆固醇（DC-Chol）、（2，3-二油酰基-丙基）-三甲胺（DOTAP）、1-{2-[9（Z）-十八烯酰基氧基]乙基}-2-[8（Z）-十七烯基]-3-（2-羟乙基）咪唑啉（DOTIM）、1，2-二油酰基-sn-丙三基-3-乙基磷酸胆碱（DOEPC）^[2]。由于脂质体的稳定性相对较差，为了提高其稳定性及增强其免疫佐剂的强度，或为了促进机体诱导产生某种特异的免疫反应，脂质体常与Poly I:C、MPL或海藻糖二山嵛酸酯（trehalose-6，6-dibehenate，TDB）等其他佐剂联合应用。

肺结核疫苗脂质体佐剂的研发主要基于DDA。DDA与TDB以质量比5∶1的形式联合应用组成佐剂CAF01。CAF01佐剂与结核分枝杆菌重组融合蛋白抗原H56组成的亚单位疫苗能引起较强且较长持续时间的抗原特异的T细胞免疫应答，尤其是Th1型和Th17型免疫应答^[3]，从而清除细胞内抗原结核分枝杆菌，提高免疫疗效。基于DMT（DDA/MPL/TDB）脂质体的肺结核亚单位CTT3H疫苗被证实不仅能增强抗原特异性CD4⁺ Th1型免疫应答，还能显著提高细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）免疫应答^[4]。

DOTIM本身免疫原性较弱，常与DNA联合作为TLRs激动剂激活细胞免疫反应。将DOTIM与胆固醇及质粒DNA联合（即JVRS-100佐剂），可引起Th1型免疫反应，主要应用于流感疫苗、乙肝疫苗及单纯疱疹病毒B疫苗等。近期研究结果发现，JVRS-100作为灭活禽流感病毒H5N1疫苗佐剂时，在雪貂模型上可显著提高病毒的免疫原性和中和抗体的滴度，从而产生较强的交叉保护免疫反应^[5]。

免疫刺激复合物（ISCOMs）是由胆固醇、磷脂酰胆碱、皂苷（主要为Quil A）和抗原形成的结构稳定的环状复合物。Quil A来源于皂树树皮，由多种水溶性皂苷组成，能激活抗体和细胞免疫反应。ISCOMs与树突状细胞相互作用后，能促进抗原交叉呈递^[6]，引起较长期的抗原特异的CD4⁺和CD8⁺ T淋巴细胞免疫应答^[7]，尤其可引起CTL免疫反应。为了提高ISCOMs的效力，ISCOMs通常与其他免疫刺激剂联合使用，如将ISCOMs和TLR9配体（CpG-ODN）联合用于肿瘤疫苗，可显著促进胰腺癌小鼠肿瘤的消退^[8]。

ISCOMATRIX佐剂的结构与ISCOMs的结构在本质上是基本一致的，ISCOMATRIX佐剂与抗原制成的疫苗同样能引起抗原交叉呈递，进而可引起较强的细胞和体液免疫反应，且其应用更加广泛，而ISCOMs仅局限于疏水性膜蛋白，此外其制备工艺更简单。有研究采用B16-OVA黑色素瘤、Panc-OVA胰腺癌和TRAMP-C1前列腺癌小鼠肿瘤模型来评价ISCOMATRIX与TLR3激动剂Poly I:C和TLR9激动剂CpG联用的治疗效果，结果表明在所有肿瘤模型中，该类疫苗能诱导产生强烈的CD8⁺ T细胞免疫反应，并能促进自然杀伤细胞和CD4⁺ T细胞的增殖，从而显著抑制肿瘤的生长，且研究结果证实ISCOMATRIX佐剂在其中发挥了至关重要的作用^[9]。

Montanide油佐剂可形成抗原储库效应，保护抗原并促进抗原被APCs摄取。法国赛比克公司研发的ISA（incomplete Seppic adjuvant）油乳佐剂系列就是基于Montanide，其主要成分为油和表面活性剂。基于Montanide的疫苗主要用于治疗肿瘤，且Montanide与其他佐剂或免疫刺激剂联合会增强其抗肿瘤效应。Wada等^[10]进行的一项临床试验结果表明，合成的NY-ESO-1重叠长肽抗原与免疫刺激剂OK-432和ISA-51联合应用能引起NY-ESO-1特异性的体液和CD4⁺及CD8⁺ T细胞免疫应答。此外，在一项I期临床试验（NCT01810016）中，采用免疫检查点抑制剂细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（CTLA-4）抗体ipilimumab（IPI）联合以Poly:ICLC和Montanide ISA-51为佐剂的NY-ESO-1疫苗治疗转移性黑色素瘤，结果表明大多数患者对IPI+NY-ESO-1疫苗的耐受性良好，且IPI+ NY-ESO-1疫苗对大多数患者来说能引起强烈的T细胞免疫应答^[11]。另有黑色素瘤临床试验结果显示，NY-ESO-1_79-108抗原肽和CpG-B以及Montanide ISA-51组成的疫苗能引起强烈且持续的抗原特异性CD8⁺和CD4⁺ T细胞免疫应答以及抗体免疫反应，IFN-γ和肿瘤坏死因子-α的分泌显著增加^[12]。

聚阳离子肽IC31是由能引起体液和Th2型免疫应答的阳离子抗菌肽KLKL₅KLK与能引起Th1型免疫应答的TLR9激动剂ODN1a组成。这两种成分联合应用可使IC31引起较强的抗原特异性体液和细胞免疫应答。IC31被广泛用于肺结核疫苗的研究，如采用H4:IC31疫苗（Ag85B和TB10.4融合蛋白抗原+ IC31佐剂）免疫先前接种过卡介苗的健康受试者，发现该疫苗具有良好的安全性，且能持续引起抗原特异性CD4⁺ T细胞免疫应答，促进T细胞的增殖和IFN-γ的产生（NCT02066428和NCT02074956）^[13]。近期的一项Ⅰ期临床试验报告表明，肺结核亚单位疫苗H1/IC31具有很好的增强Th1型免疫应答和抗体免疫应答的能力^[14]。

纳米乳剂MF59由角鲨烯、聚山梨醇酯80和司盘85组成，是粒径在250 nm左右的水包油型乳剂。MF59安全性较好，1997年欧洲批准其用于流感疫苗，是继铝佐剂后第一个用于人类疫苗的佐剂，被广泛用于流感疫苗研究。MF59佐剂能募集APCs至抗原注射位点，刺激APCs成熟，促进APCs对抗原的摄取及迁移至引流淋巴结^[15]。由于老年人的免疫系统功能下降，无佐剂辅助的三价灭活流感疫苗（trivalent inactivated fluenza vaccine，TIV）对老年人的保护效力要低于年轻人，故加入佐剂如MF59来提高流感疫苗的免疫原性不失为一种解决方法。一项65岁及以上老年人的临床试验（NCT01162122）结果证明，MF59作为TIV的佐剂能显著提高抗体反应^[16]。Fluad，即ATIV（以MF59为佐剂的TIV）被批准用于65岁及以上的老年人；Fluad Pediatric是将Fluad中的MF59剂量减半，2015年加拿大批准其用于6个月至2岁的儿童。MF59与TLR4激动剂E6020合用作为重组Men B抗原的佐剂能显著提高抗体产生水平，且E6020包载于MF59乳剂中所产生的免疫效果优于两者简单地混合^[17]。在肿瘤疫苗研究方面，采用以Poly I:C和MF59为佐剂的生存素表位肽疫苗免疫黑色素瘤小鼠，能抑制肿瘤生长，引起强烈的体液和细胞免疫反应^[18]。

佐剂系统Adjuvant systems^TM是由葛兰素史克公司研发的佐剂，包括AS04、AS03、AS02和AS01。AS04是MPL和氢氧化铝的联合，被批准用于人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）（Cervarix）和乙肝病毒（Fendrix）疫苗。MPL可促进IFN-γ的产生进而引起Th1型免疫反应，其与仅引起Th2型免疫反应的铝佐剂联合应用可发挥更大效力。葛兰素史克公司研发的二价AS04-HPV-16/18疫苗Cervarix适用于9~25岁的女性群体，需经3次免疫接种。一项针对4~6岁女童的Ⅲ期临床试验（NCT01627561）结果表明，2剂次免疫程序接种AS04-HPV-16/18疫苗安全性良好，能产生足够的抗体反应^[19]。AS03是一种水包油型佐剂，由α-生育酚、角鲨烯以及稳定乳剂的聚山梨醇酯80组成，已被美国食品药品监督管理局批准用于流感疫苗。α-生育酚能调节一些细胞因子的表达如白细胞介素6、集落刺激因子3、趋化因子CCL2、CCL3和CXCL1，促进负载抗原的树突状细胞、单核细胞和粒细胞迁移至引流淋巴结。有研究结果表明，α-生育酚的存在能显著提高体液免疫反应^[20]。在一项Ⅱ期临床试验（NCT01942265）中，以AS03为佐剂的单价灭活H7N9流感疫苗组在两次免疫接种后较不加佐剂组和MF59佐剂组产生了更高的抗体滴度^[21]。另有两项临床试验（NCT00968539和NCT00989287）结果表明，以AS03作为佐剂的A（H1N1）pdm09流感疫苗能引起持续的体液和细胞免疫反应^[22]。AS02是由MPL和QS21组成的水包油乳剂，被用于疟疾疫苗。其中QS21是从Quil A中纯化得到的皂苷，能引起抗原特异性抗体免疫应答、细胞免疫和CTL免疫反应^[23]。在一项II期临床试验（NCT00443131）中，RTS，S/AS01和RTS，S/AS02疫苗均引起了较强的环子孢子抗原特异性体液免疫和细胞免疫应答，且RTS，S/AS01疫苗引起的抗原特异性抗体水平显著高于RTS，S/AS02疫苗^[24]。AS01同样由MPL和QS21组成，相较于AS02的水包油剂型，其为脂质体混悬液。研究结果发现，注射AS01后，在肌肉注射位点和引流淋巴结部位细胞因子迅速产生，固有免疫细胞迅速募集；24 h后，以AS01为佐剂的疫苗引流淋巴结部位激活的抗原负载的单核细胞和树突状细胞数目要多于不加佐剂的疫苗^[25]。2017年，葛兰素史克公司研发的带状疱疹疫苗Shingrix（糖蛋白E+AS01B佐剂系统）获美国食品药品监督管理局批准，用于50岁及以上成人的预防。另外，RTS，S/AS01E疫苗在非洲儿科Ⅲ期临床试验中显示能显著增强CD4⁺ T细胞免疫应答^[26]。

与传统疫苗相比，新一代疫苗如亚单位疫苗、合成肽疫苗、基因工程疫苗等虽毒性减弱，但免疫原性也有所降低，需佐剂的辅助以提高疫苗的效力。老年人、婴幼儿和慢性疾病患者等免疫功能低下的群体对效力更高、安全性更好的疫苗的需求尤为迫切，这也促进了佐剂的研发。

佐剂可通过作为抗原递送载体或免疫刺激剂来发挥作用。AS01脂质体混悬液、MF59纳米乳佐剂、阳离子脂质体佐剂等不仅是抗原递送载体，同时含有免疫刺激剂，这种双重作用使疫苗更为有效。几种佐剂的联合应用可能产生协同或叠加作用，当然也可能会产生更大的毒副作用。目前，由于人们对单一佐剂的作用机制有所了解，但并非完全清楚，因此多种佐剂联合后，其发挥作用的机制尚需进一步地研究探索。作用机制的阐明将为佐剂之间配伍应用提供理论依据，避免盲目的实验筛选，尤其在针对某种特定疾病选用佐剂时会有侧重点，如肺结核、癌症，考虑到需要清除细胞内抗原、杀伤肿瘤细胞，则选用能引起强烈细胞免疫应答的佐剂。此外，联合应用的佐剂中不同佐剂的使用比例以及接种的剂量、频次、间隔等均需考虑，由此增加了联合佐剂开发的复杂性。成功的佐剂联合，在发挥最大效力的同时还需减少单一佐剂的用量以降低不良反应。目前佐剂种类繁多，随着对不同佐剂的特性和作用机制的了解，有望研究出更多能诱导产生特定免疫反应的佐剂联合配方，从而设计出更加安全有效的疫苗。