研究透明质酸（HA）修饰的聚合物纳米粒共递送佐剂和抗原对小鼠骨髓树突状细胞（BMDCs）的成熟与活化效应。
以HA修饰的聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）及阳离子脂质DOTAP为纳米载体（DOTAP-PLGA）共递送佐剂CpG与模型抗原卵清蛋白（OVA），其中CpG共价结合到纳米粒表面的HA上，OVA物理共混于DOTAP-PLGA纳米载体中。采用透射电子显微镜和动态光散射表征纳米粒；考察纳米粒中CpG和OVA的体外释放情况；利用流式细胞术和激光扫描共聚焦显微镜研究纳米粒在小鼠BMDCs中的摄取和分布；利用流式细胞术和酶联免疫吸附实验分别评价小鼠BMDCs的成熟和细胞因子的表达。
制备了共负载CpG和OVA的纳米粒CpG-HA-OVA-PLGA，平均粒径为（305.1±2.2）nm，多分散系数为0.203，透射电子显微镜可观察到经HA修饰的纳米粒有明显的核-壳结构。细胞实验结果表明，CpG-HA-OVA-PLGA纳米粒可被小鼠BMDCs有效摄取并促进CpG的溶酶体释放和抗原OVA的胞质递送；与游离OVA组和游离OVA+CpG组相比，CpG-HA-OVA-PLGA纳米粒组可显著提高BMDCs的共刺激分子CD86和CD40（均P<0.01）、主要组织相容性复合物I以及细胞因子肿瘤坏死因子-α（均P<0.001）的表达。
HA修饰的CpG和OVA的纳米粒共递送载体能有效促进树突状细胞的成熟与活化，为研制新型疫苗载体共递送抗原和佐剂提供了依据。
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肿瘤免疫疗法是近年来治疗恶性肿瘤的一项新策略，其中肿瘤疫苗逐渐成为研究热点。能有效诱导细胞免疫反应和抗原特异性细胞毒T淋巴细胞应答已成为肿瘤疫苗设计的主要瓶颈之一[1,2]。抗原提呈细胞（antigen presenting cells，APCs），如树突状细胞（dendritic cells，DCs），主要通过主要组织相容性复合物Ⅰ（major histocompatibility complex Ⅰ，MHC-Ⅰ）途径提呈外源性抗原（即交叉提呈），是诱导抗原特异性细胞毒T淋巴细胞免疫应答的主要机制[3,4,5]。实现外源性抗原MHC-I提呈途径，需将抗原递送至DCs胞质中。已有研究结果证实，聚合物纳米粒可有效促进抗原的溶酶体逃逸，实现抗原的胞质递送，从而有效提高肿瘤疫苗的抗肿瘤效应[6,7]。
研究结果表明，抗原作为疫苗的单一组分难以有效激活体内免疫系统，一些佐剂如Toll样受体（Toll-like receptors，TLRs）可用来增强疫苗激活体内免疫系统应答能力。其中，TLR9激动剂CpG寡脱氧核苷酸可被APCs中溶酶体表面的TLR9识别，增强固有免疫应答与细胞免疫应答，因此常用作细胞免疫佐剂[8,9]。但其细胞摄取量低，清除速率快，临床试验中常以高剂量重复给药，易产生诸多不良反应。因此，设计构建可同时增加CpG摄取量和稳定性的递送系统尤为重要。
APCs的激活是肿瘤疫苗发挥作用的重要步骤。实现抗原和佐剂CpG的共递送，可更有效地激活APCs，诱导产生更强的抗原特异性免疫应答。但TLR9在溶酶体表面表达，不需实现溶酶体逃逸，因此将CpG分布在溶酶体才可发挥其佐剂作用[10,11]。基于此，本研究以透明质酸（hyaluronic acid，HA）修饰的聚乳酸-羟基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA]及阳离子脂质（2，3-二油酰基-丙基）-三甲胺[（2，3-dioleoyloxy-propyl）-trimethylammonium，DOTAP]为纳米载体（DOTAP-PLGA）共递送佐剂CpG与模型抗原卵清蛋白（ovalbumin，OVA），其中CpG共价结合至纳米粒表面的HA上，OVA物理共混于PLGA纳米载体中，以此制备得到CpG-HA-OVA-PLGA纳米粒。该纳米粒可通过共递送佐剂CpG和抗原OVA促进CpG的溶酶体释放和抗原OVA的胞质递送，有效促进DCs的成熟与活化。HA是一种可生物降解、无毒的线性多糖，由D-葡糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖组成[12,13]。DCs的溶酶体中含有高浓度的透明质酸酶（hyaluronidase, HAase），可快速降解HA释放佐剂CpG。本课题组前期研究结果已证实，HA修饰的DOTAP-PLGA杂化纳米粒可促进抗原的交叉提呈[14]。本研究旨在研究共递送佐剂CpG和抗原OVA的纳米粒对DCs成熟与活化效应的影响。
CpG[生工生物工程（上海）股份有限公司]，OVA（纯度>99%）、HAase、Quant-iTTM OliGreen单链DNA定量检测试剂盒（美国Sigma-Aldrich公司），N-ε-马来酰亚胺己酸肼（美国Thermo Scientific公司），二喹啉甲酸蛋白浓度测定试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司），小鼠肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）酶联免疫吸附测定试剂盒、荧光标记的亚美尼亚仓鼠抗小鼠的单克隆抗体[PerCP-Cy5.5-CD11c、PE-CD40、异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）-CD86、APC-MHC-Ⅰ]（美国eBioscience公司）。健康无特定病原体级6~8周龄C57BL/6雌性小鼠15只，体质量范围16~18 g，购于北京华阜康实验动物公司，许可证号SCXK（京）2014-0004。
Nano-ZS90激光粒度分析仪（英国Malvern公司），Varioskan Flash 3001全波长多功能酶标仪（美国Thermo Scientific公司），Accuri C6流式细胞仪（美国BD公司），Tecnai F20透射电子显微镜（美国PEI公司），VCX130PB超声波破碎仪（美国Sonics & Materials公司），Avanti J-26S超速离心机（美国Beckman Coulter公司），LSM710激光扫描共聚焦显微镜（confocal laser scanning microscopy, CLSM）（德国Carl Zeiss公司）。
CpG-HA-OVA-PLGA纳米粒的制备方法如图1所示。先将PLGA与DOTAP溶于有机相二氯甲烷中，OVA溶于水相中，采用水包油包水（W/O/W）乳化溶剂挥发法制备得到OVA-PLGA纳米粒，室温搅拌过夜，离心，收集OVA-PLGA纳米粒；然后将OVA-PLGA纳米粒与HA通过电荷间相互作用结合，得到HA-OVA-PLGA纳米粒；再利用催化剂N-ε-马来酰亚胺己酸肼将CpG共价偶联至HA上，得到CpG-HA-OVA-PLGA纳米粒。采用激光粒度分析仪测定稀释的纳米粒粒径及Zeta电位，并向碳膜铜网上滴加新制备的纳米粒，自然晾干后采用透射电子显微镜观察其形态及大小。
OVA—卵清蛋白；PLGA—聚乳酸-羟基乙酸共聚物；HA—透明质酸；EMCH—N-ε-马来酰亚胺己酸肼；DOTAP—（2，3-二油酰基-丙基）-三甲胺
将CpG-HA-OVA-PLGA纳米粒加入磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）（pH7.4）中，分别考察PBS中加入或不加入HAase条件下，CpG-HA-OVA-PLGA纳米粒中OVA和CpG的释放情况。释放液中的OVA用二喹啉甲酸蛋白浓度测定试剂盒测定，CpG用Quant-iTTM OliGreen单链DNA定量检测试剂盒测定。
实验用的6~8周龄雌性C57BL/6小鼠在无特定病原体级环境中分笼饲养，室内温度为20~26 ℃，相对湿度为50%~70%，光照循环条件是12 h明/12 h暗，自由饮食进水。取6~8周雌性C57BL/6小鼠，脱颈椎处死后浸泡于体积分数为75%的乙醇中；快速剥离小鼠大腿骨并转移至含有培养基的培养皿中，两端剪开，用注射器轻轻吹出骨髓，并反复吹打至细胞散开；将细胞过筛后离心，弃上清，加入2 ml红细胞裂解液重悬细胞，2 min后加入培养基稀释；再次离心，用完全培养基重悬，接种于培养皿中，加入粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（20 ng/ml）和白细胞介素-4（10 ng/ml）刺激培养，在37 ℃、5%CO2培养箱中培养7 d后得到成熟的小鼠骨髓树突状细胞（bone marrow-derived dendritic cells, BMDCs）。
将小鼠BMDCs以1×105个/孔的密度接种于24孔板，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养过夜；预先用FITC标记OVA，Cy3标记CpG，并制备荧光标记的CpG-HA-OVA-PLGA纳米粒，按OVA质量浓度为10 μg/ml、CpG质量浓度为2.5 μg/ml分别将游离OVA、游离OVA+CpG和CpG-HA-OVA-PLGA纳米粒加入孔板中，37 ℃孵育6 h；收集细胞，用PBS清洗后加入PerCP-Cy5.5-CD11c抗体，4 ℃避光孵育30 min；再用PBS清洗细胞，加入0.4 ml PBS重悬细胞，采用流式细胞仪进行分析。
将小鼠BMDCs以1×105个/皿的密度接种于共聚焦培养皿，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养过夜；预先用FITC标记OVA，Cy3标记CpG，并制备荧光标记的CpG-HA-OVA-PLGA纳米粒，按OVA质量浓度为10 μg/ml、CpG质量浓度为2.5 μg/ml分别将游离OVA、游离OVA+CpG和CpG-HA-OVA-PLGA纳米粒加入培养皿中，37 ℃孵育6 h；PBS清洗3次后固定，用Lyso Tracker-Red染溶酶体，4'，6-二脒基-2-苯基吲哚染核，于CLSM下观察OVA与CpG在小鼠BMDCs中的分布情况。
将小鼠BMDCs以1×105个/孔的密度接种于24孔板，置于37 ℃、5%CO2培养箱中进行培养；培养7 d后，按OVA质量浓度为10 μg/ml、CpG质量浓度为2.5 μg/ml分别加入游离OVA、游离OVA+CpG和CpG-HA-OVA-PLGA纳米粒，与细胞共孵育6 h；更换新鲜培养基，继续培养24 h；收集细胞上清，用TNF-α酶联免疫吸附测定试剂盒测定上清中的TNF-α含量；收集细胞，分别加入PE-CD40、FITC-CD86和APC-MHC-Ⅰ抗体，置于4 ℃冰箱避光孵育30 min；PBS清洗2次，再用0.4 ml PBS重悬细胞，采用流式细胞仪进行分析。
采用GraphPad Prism 5.0统计学软件处理数据，符合正态分布的计量资料以均值±标准差（
±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析后采用Turkey检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。
如表1所示，制备的OVA-PLGA纳米粒的粒径为（150.2±1.5）nm，多分散系数为0.175，Zeta电位为35.40 mV，表面带有正电荷；HA-OVA-PLGA纳米粒的粒径增至（274.7±4.4）nm，多分散系数为0.182，Zeta电位为-16.36 mV，表面电位由正电荷变为负电荷，表明HA成功结合至OVA-PLGA纳米粒表面；CpG-HA-OVA-PLGA纳米粒的粒径为（305.1±2.2）nm，多分散系数为0.203，Zeta电位降至-20.30 mV。OVA及CpG含量测定结果表明，CpG-HA-OVA-PLGA纳米粒中OVA负载量为（21.61±3.33）μg/mg，CpG负载量为（4.84±0.23）μg/mg。透射电子显微镜观察结果显示，经HA修饰的纳米粒（HA-OVA-PLGA纳米粒及CpG-HA-OVA-PLGA纳米粒）具有明显的核-壳结构（图2）。
OVA—卵清蛋白；PLGA—聚乳酸-羟基乙酸共聚物；HA—透明质酸
OVA-PLGA纳米粒、HA-OVA-PLGA纳米粒及CpG-HA-OVA-PLGA纳米粒的表征（
±s，n=3）
OVA-PLGA纳米粒、HA-OVA-PLGA纳米粒及CpG-HA-OVA-PLGA纳米粒的表征（±s，n=3）
| 纳米粒名称 | 粒径（nm） | 多分散系数 | Zeta电位（mV） | OVA负载量（μg/mg） | CpG负载量（μg/mg） |
|---|---|---|---|---|---|
| OVA⁃PLGA | 150.2±1.5 | 0.175±0.01 | 35.40±0.30 | 24.32±0.74 | — |
| HA⁃OVA⁃PLGA | 274.7±4.4 | 0.182±0.02 | -16.36±0.26 | 23.22±1.67 | — |
| CpG⁃HA⁃OVA⁃PLGA | 305.1±2.2 | 0.203±0.04 | -20.30±1.00 | 21.61±3.33 | 4.84±0.23 |
注：OVA—卵清蛋白；PLGA—聚乳酸-羟基乙酸共聚物；HA—透明质酸；"—"指不存在
细胞溶酶体内的HAase浓度较高，可水解HA[15,16]。因此在体外释放实验中，分别在pH7.4的PBS中加入或不加入HAase，以此考察HAase对CpG-HA-OVA-PLGA纳米粒中OVA和CpG释放的影响。结果如图3所示，在HAase的作用下，CpG和OVA从纳米粒中的释放速率均高于不含HAase的释放体系，在7 d的释放期内，OVA和CpG的累积释放率分别达75%和60%。
PBS—磷酸盐缓冲液；HAase—透明质酸酶；HA—透明质酸；OVA—卵清蛋白；PLGA—聚乳酸-羟基乙酸共聚物
利用流式细胞术分析CpG-HA-OVA-PLGA纳米粒在小鼠BMDCs中的摄取。结果如图4所示，CpG-HA-OVA-PLGA纳米粒与小鼠BMDCs共孵育后，FITC-OVA和Cy3-CpG的荧光强度均明显高于游离OVA组和游离OVA+CpG组，差异均具有统计学意义（均P<0.001），表明CpG-HA-OVA-PLGA纳米粒可被小鼠BMDCs高效摄取，增加OVA和CpG的胞内递送。
1—游离OVA；2—游离OVA+CpG；3—CpG-HA-OVA-PLGA纳米粒；HA—透明质酸；OVA—卵清蛋白；PLGA—聚乳酸-羟基乙酸共聚物；FITC—异硫氰酸荧光素。与CpG-HA-OVA-PLGA纳米粒组比较，aP<0.001
采用CLSM观察荧光标记的CpG-HA-OVA-PLGA纳米粒在小鼠BMDCs中的分布。结果如图5所示，与游离OVA组以及游离OVA+CpG组相比，CpG-HA-OVA-PLGA纳米粒与小鼠BMDCs共孵育6 h后摄取量增加。同时，还可观察到CpG-HA-OVA-PLGA纳米粒进入细胞后，FITC标记的OVA主要位于红色溶酶体中，且有小部分绿色荧光与溶酶体无重合，提示CpG-HA-OVA-PLGA纳米粒可促进OVA溶酶体逃逸进入细胞质中。目前，已有文献报道，抗原的胞质递送可促进抗原的交叉提呈，进而激活CD8+ T细胞[17,18]。溶酶体表面表达TLR9分子，CpG作为TLR9激动剂，可与溶酶体表面的TLR9结合而发挥作用。如图5所示，Cy3标记的CpG可通过CpG-HA-OVA-PLGA纳米粒实现与溶酶体共定位。上述结果表明，CpG-HA-OVA-PLGA纳米粒可实现抗原OVA的交叉提呈，并有效递送佐剂CpG至溶酶体内发挥作用。
HA—透明质酸；OVA—卵清蛋白；PLGA—聚乳酸-羟基乙酸共聚物。蓝色荧光为Cy3标记的CpG，绿色荧光为异硫氰酸荧光素标记的OVA，红色荧光表示溶酶体，青色荧光表示细胞核
成熟的DCs表面表达共刺激分子CD40和CD86[19]，利用流式细胞术分析DCs表面CD40和CD86的表达可显示DCs的成熟度。如图6A、图6B所示，与游离OVA组和游离OVA+CpG组相比，CpG-HA-OVA-PLGA纳米粒组BMDCs表面CD40和CD86的表达明显升高，差异均具有统计学意义（均P<0.01）。有文献报道，聚合物纳米粒递送系统可将抗原递送至胞质，上调MHC-I的表达，诱导CD8+ T细胞活化[20]。如图6C所示，与游离OVA组和游离OVA+CpG组相比，CpG-HA-OVA-PLGA纳米粒组BMDCs表面MHC-I的表达明显升高，差异均具有统计学意义（均P<0.001）。上述结果表明，CpG-HA-OVA-PLGA纳米粒被BMDCs摄取后，可促进BMDCs的成熟和抗原的交叉提呈。TNF-α是成熟DCs的标志性因子，对促进细胞免疫反应尤为重要[21]。如图6D所示，与游离OVA组和游离OVA+CpG组相比，CpG-HA-OVA-PLGA纳米粒与小鼠BMDCs共孵育后，可明显增加TNF-α的分泌，差异均具有统计学意义（均P<0.001）。
1—游离OVA；2—游离OVA+CpG；3—CpG-HA-OVA-PLGA纳米粒；OVA—卵清蛋白；HA—透明质酸；PLGA—聚乳酸-羟基乙酸共聚物；BMDCs—骨髓树突状细胞；MHC-I—主要组织相容性复合物I；TNF-α—肿瘤坏死因子-α。与CpG-HA-OVA-PLGA纳米粒组比较，aP<0.01，bP<0.001
本研究成功制备了CpG-HA-OVA-PLGA纳米粒，实现了佐剂CpG和抗原OVA的共递送。制备的CpG-HA-OVA-PLGA纳米粒可被小鼠BMDCs有效摄取，并促进CpG的溶酶体释放和抗原OVA的胞质递送。与游离CpG和OVA相比，共负载CpG和OVA的纳米粒可显著提高BMDCs的共刺激分子CD86和CD40、MHC-I以及细胞因子TNF-α的表达，促进BMDCs的成熟与活化。本研究提出了一种实现抗原和佐剂联合递送的疫苗新策略，为研制新型疫苗载体共递送抗原和佐剂提供了依据。
无
