刘斌; 施燕平; 徐志洲; 卢建; 刘莉莉

doi:10.3760/cma.j.issn.1673-4181.2018.05.010

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• 论著 •

微波消解/ICP-MS测定胶原蛋白中14种金属元素的研究

国际生物医学工程杂志, 2018,41(5) : 428-433. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1673-4181.2018.05.010

摘要

目的

建立测定胶原蛋白中Mn、Cu、Zn、Al、Ti、Pb、Ba、Cd、Co、Cr、Ni、Fe、As和Hg 14种金属元素的方法。

方法

首先优化了胶原蛋白微波消解的条件、电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）工作条件以及各金属元素在ICP-MS测定中采用的模式，采用微波消解/ICP-MS测定了9个不同规格型号的胶原蛋白样品中的14种金属元素含量，同时进行了加标回收验证和方法准确性测定。

结果

仪器检出限为0.1~5.0 μg/L，方法检出限为0.001 25~0.625 mg/kg，测定的相对标准偏差（n=11）不大于4.0%，样品的回收率均在87.7%~107.4%。在相同条件下，对猪肝标准品中的14种金属元素进行了测定，测定值均在标准范围内。

结论

本研究建立的微波消解/ICP-MS法具有快速、简便、灵敏度高、稳定性好、准确度高等优点，值得借鉴和推广。

引用本文: 刘斌, 施燕平, 徐志洲, 等. 微波消解/ICP-MS测定胶原蛋白中14种金属元素的研究 [J] . 国际生物医学工程杂志, 2018, 41(5) : 428-433. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1673-4181.2018.05.010.

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0　引言

胶原蛋白是动物体内含量最丰富的蛋白，具有低毒性、低抗原性和低免疫性^[1,2,3,4]，能抑制上皮组织细胞迁移、引导细胞再生，其与人体相容性较好^[5,6]，是临床医疗应用较理想的生物医学材料^[7,8,9,10]。胶原蛋白在医疗器械中多作为止血材料使用，其在体内直接接触组织和血液，于体内降解而非术后取出。因此，胶原蛋白按Ⅲ类医疗器械进行严格监管，以保证其对人体的安全性和有效性。

金属元素毒性大、潜伏期长，有研究结果证明，Cu、Pb、Cr等金属元素是造成人类生殖障碍的重要致病因子之一^{[11,12,13,14]}。而胶原蛋白产品中的微量金属元素能直接接触人体血液、器官和组织，相对于胃肠道吸收可能产生更严重的后果，因此引起研究者的关注。

胶原蛋白中的金属元素杂质通常是在生产过程中，通过原料、生产工艺中所用的不锈钢反应釜、金属材质工具和玻璃容器的腐蚀与溶出以及生产环境、运输贮存等途径引入。金属元素杂质引入途径繁杂，避免污染难度大，且由于动物源生物材料的特殊结构，其所含的肽、羧基、巯基等官能团对金属元素具有一定的吸附和富集作用，从而增加了胶原蛋白在生产过程中被金属元素污染的概率。对胶原蛋白产品中的金属元素种类及含量进行测定，对于生产企业改进、完善工艺和设备选型，提高产品质量，生产出更优质胶原蛋白产品具有重要的参考价值。

目前，对生物材料中金属元素的含量测定一般采用中国药典的方法，取炽灼残渣做金属总量的比色检测。但这类基于硫化物沉淀颜色强度的方法非特异、不灵敏且费时费力，通常回收率很低，无法对每种金属元素进行微量甚至痕量分析，从而无法满足日益严格的医疗产品质量控制需要^[15]。有研究者采用电感耦合等离子体质谱（inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS）替代比色法测定生物材料中的金属元素含量^[16]。

传统的元素分析方法包括分光光度法、原子吸收法（火焰与石墨炉）、原子荧光光谱法、ICP发射光谱法均有各自的优缺点，或是样品前处理复杂，需萃取、浓缩富集或抑制干扰；或是不能进行多组分或多元素同时测定，费时费力；或是仪器的检出限或灵敏度达不到指标要求等。ICP-MS技术克服了传统方法的大多数缺点，具有灵敏度高、抗干扰、检出限低、重复性好等优点。

本研究使用ICP-MS测定胶原蛋白中的14种金属元素，不同金属元素采用对应的不同方法（标准法、反应法、碰撞法）测定回收率、方法及仪器检出限、精密度和重复性。通过对国家标准物质中14种金属元素的测定验证该方法的准确性和可行性。

1　材料与方法

1.1　主要材料与仪器

硝酸（美国化学协会级试剂）（美国J.T.Baker公司），多元素标准溶液（100 mg/L，GSB 04-2824-2011）、多元素标准溶液（100 mg/L，GSB 04-1767-2004）（国家有色金属及电子材料分析测试中心），GBW10051（GSB-29）猪肝标准品（中国地质科学院地球物理地球化学勘查研究所）。

本研究共收集了8家生产企业的9个不同规格型号的胶原蛋白样品进行测定分析，其中包括进口产品3个。样品信息如表1所示。

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表1

收集的胶原蛋白样品信息

表1

收集的胶原蛋白样品信息

样品编号	规格型号	单包装质量（g）
1⁃1	SyringeAvitene（1.0 g）	1.000 0
1⁃2	80 mm×125 mm	1.000 0
2	50 mm× 50 mm	0.161 5
3	80 mm× 50 mm×5 mm	0.244 2
4	80 mm×120 mm×5 mm	1.035 8
5	40 mm× 60 mm×4 mm	0.129 5
6	50 mm× 50 mm×5 mm	0.139 7
7	50 mm× 50 mm×5 mm	0.206 7
8	55 mm× 65 mm	0.168 8

NexION 350D ICP-MS（美国PerkinElmer公司），Multiwave Pro超高压微波消解系统（奥地利安东帕公司），Milli-Q^® Advantage A10超纯水系统（德国Merck Millipore公司）。

1.2　方法

1.2.1　仪器调谐状态

Be：11 530.4；In：232 674.1；U：164 251.4；CeO/Ce：0.109；Ce++/Ce：0.012；Bkgd：0.300。

1.2.2　ICP-MS工作条件

ICP-MS全质量数扫描参数如下：扫描模式为跳峰模式；工作模式为标准模式；雾化器气体流速为1.00 ml/min；ICP射频功率为1 600 W；辅助气流速为1.20 L/min；等离子体气流速为18.00 L/min；扫描/读数为12；每单位质量数驻留时间为50 ms。ICP-MS定量检测参数见表2。

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表2

电感耦合等离子体质谱定量检测参数

表2

电感耦合等离子体质谱定量检测参数

部件/参数	类型/数值/模式
雾化器	同心雾化器
喷射室	玻璃旋流雾室
三角锥表面材质	Pt
等离子体气流速	16.0 L/min
辅助气流速	1.20 L/min
雾化器气体流速	1.00~1.05 L/min
样品吸入速率	250 μL/min
射频功率	1 600 W
驻留时间	500~1 500 ms
样品重复测定次数	3
操作模式	标准、碰撞（用He）、反应（用NH₃）

1.2.3　供试品溶液的制备

精密称取已剪碎的胶原蛋白样品0.2 g（精确至0.000 1 g），置于聚四氟乙烯消解罐内，加入10 ml硝酸混匀，浸泡过夜；盖上内盖，旋紧外套，置于超高压微波消解系统中，按表3进行消解；消解完毕后，取消解内罐置于电加热器上，120 ℃加热直至红棕色蒸汽挥尽并近干，用体积分数为2%的硝酸转移至25 ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；同法制备试剂空白溶液，作为空白校正。

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表3

微波消解条件

表3

微波消解条件

步骤	功率（W）	升温时间（min）	温度（℃）	保持时间（s）
1	1 600	5	120	3
2	1 600	6	150	2
3	1 600	6	180	20

1.2.4　检测方法

用ICP-MS对供试品溶液进行全质量数扫描（6~15 amu，19~39 amu，42~210 amu，230~240 amu），选取有响应值的金属元素用ICP-MS按表2参数进行定量分析。

2　结果

全质量数扫描金属元素共69种，包括Li、Be、B、Na、Mg、Al、K、Ca、Sc、Ti、V、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、Ga、Ge、As、Se、Kr、Rb、Sr、Y、Zr、Nb、Mo、Ru、Rh、Pd、Ag、Cd、In、Sn、Sb、Te、Xe、Cs、Ba、La、Ce、Pr、Nd、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu、Hf、Ta、W、Re、Os、Ir、Pt、Au、Hg、Tl、Pb、Bi、Th和U元素。其中有响应值的金属元素14种，分别为Mn、Cu、Zn、Al、Ti、Pb、Ba、Cd、Co、Cr、Ni、Fe、As和Hg元素，对其进行ICP-MS定量分析。

2.1　实际样品的测定

采用ICP-MS测定了8家生产企业9个不同规格型号的胶原蛋白样品中的上述14种金属元素，结果见表4。

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表4

9个不同规格型号的胶原蛋白样品中14种金属元素的电感耦合等离子体质谱测定结果（μg/g）

表4

9个不同规格型号的胶原蛋白样品中14种金属元素的电感耦合等离子体质谱测定结果（μg/g）

样品编号	Mn	Cu	Zn	Al	Ti	Pb	Ba	Cd	Co	Cr	Ni	Fe	As	Hg
1⁃1	0.09	0.47	1.60	ND	0.65	0.01	0.03	ND	0.01	ND	0.20	9.12	0.01	0.01
1⁃2	0.18	1.92	2.67	ND	0.57	0.11	0.08	ND	0.02	1.03	1.30	22.07	ND	ND
2	0.67	0.82	1.48	10.21	2.18	0.10	0.71	ND	0.05	14.41	5.31	203.70	0.02	0.02
3	1.19	0.89	10.60	ND	1.00	0.31	2.60	ND	0.05	21.43	3.11	183.35	0.01	0.01
4	0.55	0.78	0.28	ND	0.61	0.01	0.09	ND	0.03	8.62	4.93	51.99	0.01	0.02
5	1.37	1.04	1.84	ND	1.58	0.05	0.33	ND	0.08	34.33	6.88	172.98	0.02	0.01
6	2.63	1.47	1.94	8.77	2.29	0.20	0.62	ND	0.03	5.15	1.73	118.41	0.02	0.01
7	0.52	0.56	1.28	ND	2.83	0.06	0.24	ND	0.06	13.90	5.31	102.38	ND	ND
8	0.55	0.90	53.26	25.59	5.04	0.09	0.27	ND	0.05	14.63	3.57	139.27	ND	0.01

注：ND—未检出

2.2　ICP-MS测定条件及方法学参数确认

本研究中供试品溶液的ICP-MS测定条件和方法学确认数据见表5。

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表5

电感耦合等离子体质谱测定条件及方法学参数确认

表5

电感耦合等离子体质谱测定条件及方法学参数确认

元素^a	质量数（amu）	模式^b	线性范围（μg/L）	仪器检出限（μg/L）	方法检出限（mg/kg）	相对标准偏差（%）（n=11）^c	重复性（%）（n=7）^d
Mn	55	反应模式	2~100	0.10	0.012 5	0.71	3.31
Cu	63	碰撞模式	5~100	0.10	0.012 5	2.01	3.55
Zn	66	碰撞模式	10~1 000	0.50	0.062 5	2.23	5.02
Al	27	标准模式	20~1 000	5.00	0.625	3.94	3.08
Ti	47	标准模式	10~1 000	0.20	0.025	2.04	1.32
Pb	208	标准模式	1~100	0.08	0.01	2.55	2.40
Ba	138	标准模式	2~100	0.10	0.012 5	1.76	2.85
Cd	111	碰撞模式	10~1 000	0.01	0.001 25	0.55	4.36
Co	59	碰撞模式	1~100	0.30	0.037 5	0.61	1.11
Cr	52	反应模式	20~1 000	0.05	0.006 25	1.55	3.76
Ni	60	碰撞模式	10~1 000	0.30	0.037 5	1.78	5.10
Fe	56	碰撞模式	50~2 000	2.00	0.25	2.72	3.46
As	75	碰撞模式	1~100	0.10	0.012 5	2.17	4.12
Hg	202	标准模式	0.1~10.0	0.01	0.001 25	1.04	4.29

注：^a混合内标⁴⁵Sc、⁷²Ge、¹⁰³Rh、¹¹⁵In、¹⁵⁹Tb的质量浓度均为50 μg/L；^b NexION 350D电感耦合等离子体质谱的3种模式：标准模式、碰撞模式（用He）和反应模式（用NH₃）；^c取1份已处理好的供试品溶液，连续进样11次，测定信号强度，计算11次测定结果的相对标准偏差值；^d精密称取同批次胶原蛋白样品0.2 g 7份，按1.2.2节供试品溶液制备方法及1.2.1节ICP-MS测定条件进行含量测定，计算相对标准偏差值

2.3　加标回收验证

精密称取胶原蛋白样品0.2 g，分别准确加入0.2和1.0 ml质量浓度为1 μg/ml的混合标准贮备液，按前述供试品溶液制备方法及ICP-MS测定条件对14种金属元素进行含量测定，样品的回收率均在87.7%~107.4%，结果见表6。

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表6

电感耦合等离子体质谱测定胶原蛋白样品中14种金属元素的加标回收结果

表6

电感耦合等离子体质谱测定胶原蛋白样品中14种金属元素的加标回收结果

元素	样品本底值（μg）	低浓度			高浓度
元素	样品本底值（μg）	加入量（μg）	测得量（μg）	回收率（%）	加入量（μg）	测得量（μg）	回收率（%）
Mn	0.526 8	0.20	0.714 0	93.6	1.0	1.540 8	101.4
Cu	0.293 7	0.20	0.490 5	98.4	1.0	1.342 7	104.9
Zn	0.388 5	0.20	0.563 9	87.7	1.0	1.315 5	92.7
Al	1.753 4	0.20	1.940 2	93.4	1.0	2.727 4	97.4
Ti	0.458 1	0.20	0.646 1	94.0	1.0	1.412 1	95.4
Pb	0.039 5	0.20	0.232 7	96.6	1.0	1.041 5	100.2
Ba	0.124 8	0.20	0.320 6	97.9	1.0	1.123 8	99.9
Cd	—	0.20	0.206 2	103.1	1.0	1.074 1	107.4
Co	0.006 8	0.20	0.199 7	96.4	1.0	1.038 8	103.2
Cr	1.030 7	0.20	1.223 5	96.4	1.0	2.049 7	101.9
Ni	0.345 0	0.20	0.534 6	94.8	1.0	1.320 0	97.5
Fe	23.681 5	0.20	23.862 9	90.7	1.0	24.663 5	98.2
As	0.003 8	0.20	0.201 2	98.7	1.0	0.948 8	94.5
Hg	0.002 3	0.20	0.187 3	92.5	1.0	0.954 3	95.2

注："—"指无此项

2.4　方法准确性的测定

本研究采用ICP-MS测定了生物成分标准物质GBW10051（GSB-29）猪肝标准品。此标准品的组织成分及金属元素种类与胶原蛋白类产品较为一致。取猪肝标准品于80 ℃烘干4 h，然后按前述供试品溶液制备方法（其中Co、Cr、Ni称样量均为1.0 g，最终定容于10 ml，其余元素称样量均为0.2 g，定容于25 ml）及ICP-MS测定条件对14种金属元素进行含量测定。结果见表7，测得的标准物质测定值均在标准范围内，表明本研究建立的ICP-MS方法可靠，对未知样品的测量准确。

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表7

电感耦合等离子体质谱测定猪肝标准品中的14种金属元素含量（μg/g）

表7

电感耦合等离子体质谱测定猪肝标准品中的14种金属元素含量（μg/g）

元素	标准值	测定值	元素	标准值	测定值
Mn	10.1±0.4	10.2	Cd	1.00±0.07	1.03
Cu	52±3	51.0	Co	0.057±0.004	0.054
Zn	211±11	213.7	Cr	0.23±0.06	0.25
Al	（0.012）	0.016	Ni	（0.10）	0.08
Ti	—	—	Fe	519±34	522.3
Pb	0.12±0.03	0.11	As	1.4±0.3	1.21
Ba	（0.24）	0.20	Hg	45±8	37.9

注："±"后数据为不确定度；括号内的数值为参考值；"—"指无此项

3　讨论

本研究结果显示，胶原蛋白样品中的Zn元素含量为3号10.6 μg/g，8号53.26 μg/g，其他样品含量较低，而Zn元素是人体必须的元素；样品中的Al元素含量为2号10.21 μg/g，8号25.59 μg/g，据统计美国人每人每天膳食Al的摄入量为7~9 mg^[17]；样品中的Ni元素含量为2号5.31 μg/g，4号4.93 μg/g，5号6.88 μg/g，7号5.31 μg/g，据评估成人每人每天膳食Ni的摄入量为200~300 μg^[18]；样品中对人体有巨大危害的Cd和As元素未检出或微量检出，说明胶原蛋白样品未被这两种元素污染。因此，样品中的Zn、Al、Ni、Cd和As元素含量对其安全性不会产生影响。

样品中的Cr元素含量为2号14.41 μg/g，3号21.43 μg/g，4号8.62 μg/g，5号34.33 μg/g，7号13.90 μg/g，8号14.63 μg/g，据评估成人每人每天膳食Cr的摄入量为30~100 μg^[19]，因此，样品中的Cr元素含量应引起对产品安全性的足够重视。

样品中的Fe元素含量在所有检出元素中含量较高（9.12~203.7 mg/kg），各样品中的Fe元素含量见图1。

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图1

电感耦合等离子体质谱测定胶原蛋白样品中的Fe元素含量

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图1

电感耦合等离子体质谱测定胶原蛋白样品中的Fe元素含量

图1中前3个样品为进口产品，后6个样品为国产产品。测定结果显示，进口产品与国产产品的Fe元素含量差距明显，后者的Fe元素含量远高于前者。仔细比对表4数据发现，除Fe元素外，进口产品中的Mn、Ni、Cr和Co元素含量也均低于国产产品。所测的9个样品中，Fe元素含量较高的样品其Cr及Ni元素含量也较高，而这3种元素即为不锈钢的主要成分。通过查找胶原蛋白的生产工艺并与生产厂家确认，胶原蛋白生产过程中除了过滤离心采用钛罐，其他生产过程均采用316L不锈钢釜。在胶原蛋白海绵的生产过程中，所用的体积分数为1%~4%的醋酸及NaCl对不锈钢具有一定的腐蚀作用，因此推测样品中Fe、Ni和Cr等金属元素的含量较高是由于加工过程中使用的不锈钢容器及加工助剂对不锈钢容器造成了腐蚀，导致这些金属污染物随着不锈钢腐蚀脱落于产品中。

4　结论

本研究结果表明，微波消解胶原蛋白较传统的方法更理想、更快捷；ICP-MS测定胶原蛋白供试品溶液操作简单、准确性和精密度高，可高效实现样品中多种金属元素的同时测定。

针对胶原蛋白海绵产品的特性，本研究建立了测定14种金属元素的方法，并进行了全面的方法学确认。通过对金属元素进行全面测定和数据分析，找出金属元素分布的共性和特性以及金属元素含量多少对人体危害程度大小。这对于指导生产企业和质量监督部门发现胶原蛋白的安全控制风险点具有重要参考价值。

利益冲突

无

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贡献者信息

刘斌

250101　济南，山东省医疗器械产品质量检验中心，山东省医疗器械生物学评价重点实验室；250101　济南，国家食品药品监督管理局济南医疗器械质量监督检验中心

施燕平

徐志洲

卢建

250101　济南，山东省医疗器械产品质量检验中心，山东省医疗器械生物学评价重点实验室

刘莉莉

通信作者

刘莉莉

Email：Liulili0728@163.com

关键词

微波消解; 电感耦合等离子体质谱; 胶原蛋白; 金属元素;

基金项目

山东省重点研发计划（2015GSF118165）

利益冲突

利益冲突　无

历史

出版日期：2018-10-28

收稿日期：2018-05-09

Original Article

Determination of 14 metal elements in collagen by inductively coupled plasma mass spectrometry with microwave digestion

Bin Liu, Yanping Shi, Zhizhou Xu, Jian Lu, Lili Liu

Published 2018-10-28

Cite as Int J Biomed Eng, 2018, 41(5): 428-433. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1673-4181.2018.05.010

Abstract

Objective

To propose an analysis method for determining 14 kinds of metal elements in collagen, including Mn, Cu, Zn, Al, Ti, Pb, Ba, Cd, Co, Cr, Ni, Fe, As and Hg.

Method

The conditions of collagen microwave digestion, inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS) working conditions and the modes used in the determination of various metal elements in ICP-MS were optimized. The content of 14 metal elements in 9 kinds of collagens with different specifications was determined by microwave digestion/ICP-MS, and the tagged recovery verification and method accuracy determination were conducted.

Results

The detection limit of the instrument was 0.1~5.0 μg/L. The detection limit of the proposed method was 0.001 25~0.625 mg/kg. The relative standard deviation (n=11) was not more than 4.0%, and the recovery rate of the sample was 87.7%~107.4%. Under the same conditions, 14 metal elements in the pig liver standard were measured and the measured values were within the standard range.

Conclusions

The microwave digestion/ICP-MS method possesses the advantages of rapidness, simplicity, high sensitivity, good stability and high accuracy. It is worthy of reference and promotion.

Key words:

Microwave digestion; Inductively coupled plasma mass spectrometry; Collagen; Metal elements

Contributor Information

Bin Liu