随着二代测序技术的出现，环状RNAs（circRNAs）再次进入人们的视线。circRNAs的特殊结构特征（不具有5'末端和3'末端的环状结构）及独特的形成机制（反向剪切）已被人们所熟知，但其生物学功能研究却相对较少。至今，研究较多的是其在核内调节pre-mRNAs剪切、亲本基因表达及在胞浆内作为miRNAs海绵竞争性抑制miRNAs的作用，相关疾病包括：帕金森疾病、糖尿病、肿瘤及心肌病等。根据circRNAs环内含有的序列性质分为：环状外显子RNAs、环状内含子RNAs及环状外显子-内含子RNAs等。circRNAs环内含有的序列主要是外显子，但该外显子是否具有指导蛋白质合成的功能仍存争议。旨在对circRNAs翻译能力相关的研究进行综述，同时为circRNAs翻译能力鉴定推荐了可能的生物信息学工具及实验室方法。
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环状RNAs（circular RNAs，circRNAs）是一类不具有5'末端帽状结构和3'末端poly（A）尾、并以共价键形成环形结构的内源性RNA分子。20世纪70年代，有研究者在高等植物的类病毒中发现了circRNAs的存在[1]。随后在其他生物体内也发现了circRNAs，如：酵母线粒体、丁型肝炎病毒等[2,3]。由于受到当时技术的限制，circRNAs被认为是mRNAs转录后异常剪切过程中的副产物且表达量较低，因此没有受到研究人员的重视[4]。
随着二代测序及生物信息学的发展，circRNAs再次受到人们的关注。研究结果显示，circRNAs广泛地表达于多种真核生物体的组织、细胞以及生长发育的不同阶段，且具有高度的保守性，有些circRNAs甚至是其对应线性RNAs表达量的10余倍[5,6]；同时，由于缺乏5'末端和3'末端，使得其比线性RNAs稳定性更高。
circRNAs根据其组成成分可分为:①环状外显子RNAs（circular exonic RNA），是circRNAs最重要组成部分，主要存在于细胞浆中。其形成机制主要是反向剪切（backsplicing），有研究者提出了环状外显子RNAs形成的2种模型，即套索驱动环化和内含子配对驱动环化[6]。前者是由pre-mRNA下游外显子的3'端连接到上游外显子的5'端，形成套索，再切除内含子，形成由外显子构成的circRNAs；后者是pre-mRNA中的2个内含子通过碱基互补配对形成套索，再切除内含子，形成circRNAs。②环状内含子RNAs（circular intronic RNA, ciRNA）主要存在于细胞核中，它的形成包含邻近5'剪接位点的7个核苷酸GU富集元件以及邻近分支点的11个核苷酸C富集元件[7]。③环状外显子-内含子RNAs（ElciRNAs）也存在于细胞核中，但其形成机制尚未明确。circRNAs主要在细胞核内形成的，而环状外显子RNAs主要存在于细胞浆中，circRNAs通过核膜转运至胞浆的机制尚没有相关的研究，其机制可能类似于miRNAs，通过其内含有的一些特定的序列来完成跨核膜转运，确切机制尚待进一步研究。
circRNAs的生物学功能正不断被认识。研究结果表明，circRNAs的功能包括：①circRNAs竞争性地抑制miRNAs。miRNAs是一类长度在21nt左右的RNA，可通过碱基互补直接与mRNA靶标相结合，从而起到抑制mRNA翻译的作用[8]。位于胞浆内的circRNAs含有多个miRNAs的结合位点，可通过与之结合而抑制miRNAs的功能。2013年，Hansen等[9]和Memczak等[10]相继证实：ciRS-7/CDR1as和Sry circRNA均可通过与特定的miRNA结合起到抑制相应miRNA功能的作用。该作用已证实与多种疾病有关，包括帕金森疾病、糖尿病及肿瘤等[11,12,13]。②circRNAs调节pre-mRNAs的剪切。Ashwal-Fluss等[14]研究结果发现，circRNAs上含有与侧翼内含子一样的RNA结合蛋白的结合位点，通过与其RNA产生的circRNAs特异性结合，可反向调节circRNAs本身的合成。③circRNAs可调控亲本基因表达。Li等[15]发现核内含有内含子的circRNAs（EIciRNAs）可在人类细胞株HEK-293中通过小核RNA（snNRA）U1依赖的方法来正性调节其亲本基因的转录。研究者同时发现，EIciRNAs中含量最多的两种（EIciEIF3J和EIciPAIP2）在转录位点的结合位点也很丰富，其可促进其亲本基因的转录。上述结果表明，以circRNAs为基础的转录调控是一个高度复杂和精密的网络。
虽然circRNAs主要由外显子构成，但在真核细胞中缺乏其来源蛋白质存在的证据，因此circRNAs一直被认为是非编码RNAs（non-coding RNAs，ncRNAs）的成员。第一次发现可以作为翻译模版编码蛋白的circRNAs来源于丁肝病毒，合成的产物是一含有122氨基酸的蛋白链[3]。同时，另一研究结果表明：被环状拟病毒转染的水稻，可以把这个由220个核苷酸构成的circRNA翻译成一个约为16 ku的蛋白质[16]。这些研究结果证明circRNAs是可以被翻译成蛋白的，故circRNAs是否存在翻译蛋白的功能仍存在争论。
众所周知，长链非编码RNAs（long noncoding RNAs，lncRNAs）不具有指导蛋白合成的功能。但近年来越来越多的研究结果表明，由于lncRNAs内部开放阅读框架（open reading frames，ORFs）的存在，一部分lncRNAs可以翻译出功能性的微小多肽片段[17]。有报告指出，存在于人类或老鼠体内名为myoregulin的lncRNA可以编码出一个约为46 ku的多肽，其可调节骨骼肌肌浆网上Ca2+-ATP依赖的钙泵[18]。
真核细胞内经典的翻译起始是7-甲基鸟苷酸结合到mRNA的5'端，随后转移到核糖体上，继而开始蛋白质的合成。作为ncRNAs的另一个成员，circRNAs和lncRNAs同样缺乏经典翻译所需要的起始元件（5'端帽状结构等）。但是，真核细胞内存在一些特殊结构[如：内部核糖体进入位点（internal ribosome entry site，IRES）]可吸引核糖体亚基作用于内在的起始密码子，继而启动翻译[19]。有研究结果证实：把人工合成的IRES导入circRNAs起始密码子的上游，可在体外完成蛋白质的合成。但上述发现仅局限于体外试验，而到目前为止尚没有确切的证据证实真核细胞内IRES是否存在，其编码蛋白质的功能尚需进一步研究。
可以发生有效体外翻译的circRNAs虽然在体内不一定发生相同的过程，但是，这一事实提示了在体内发生翻译的可能。Li和Lytton[20]报道了一个circRNAs指导蛋白质合成的实例。研究者发现：转染到人类细胞株HEK-293中的Na+/Ca2+交换基因1（NCX1）可产生一circRNA，其可以指导细胞产生一种缩短的蛋白质。这一情况出现在环状NCX1中第2个外显子异常增多的时候，其翻译出的蛋白质与设想的蛋白分子大小一致，约70 ku。更令人惊讶的是，该蛋白质在细胞内发挥着抑制Na+/Ca2+交换的作用。然而，相同大小的蛋白质不能从组织细胞中分离得到，仅能见到一些较短的片段，可能是由于来源于该circRNA的蛋白质被水解引起，其是一个circRNA翻译出内源性多肽的实例。但是，前后结果的不一致使得其不能完全支持体内存在circRNAs来源的蛋白质这一观点。
Abe等[21]提供了circRNAs可在体内作为蛋白质合成模版的强力证据，该团队证实了含有ORFs的circRNAs可通过一个称为环形放大（RCA）的机制来指导蛋白质的合成。该机制不依赖于现已发现的任何翻译起始所必需的特定元件，如：真核生物的多聚A尾，帽状结构等。除上述提到了两种非经典的翻译起始机制，机体内尚存在其他的蛋白质翻译途径，如：非AUG起始密码子（CUG或GUG密码子）起始途径，翻译模版切换途径等，这些都可以启动翻译，而这些情况是需要考虑的[22,23]。
尽管上述研究证实circRNAs在体内外都具有指导蛋白翻译的功能，且很多circRNAs与外显子具有重合的部分，但争论更倾向于circRNAs的翻译效能很低这一观点。原因包括：①由于circRNAs是一个环状结构，故其起始位点和终止位点互相紧靠，可能会相互影响。同时，翻译的延长及终止等需要辅助因子与5'端的帽状结构和3'端的多聚A尾相结合[24,25]，而缺乏这些结构的circRNAs势必会影响蛋白的合成。②由于circRNAs所含有的ORFs缺乏其应有的进化保守性，故该ORFs不是典型的ORFs[26]。同时，该ORFs理论的蛋白产物即使在来源于其他物种的已知蛋白生物信息数据库中也未能找到其同源性蛋白[27]，说明circRNAs不具有指导蛋白合成的功能，或者合成效率很低。
核糖体印记技术（ribosome footprinting）最早由Ingolia等[28]提出，其使用核酸酶消化mRNAs技术，但翻译过程中发挥作用的核糖体所结合的RNAs却被核糖体保护（PRFs），而不受核酸酶的降解，随后分离出这些受保护的片断并用深度测序技术进行测序，从而鉴别出编码RNAs和ncRNAs。通过该方法有研究者鉴定出一些较短、多顺反子及与核糖体相关的RNAs，这些RNAs可以在老鼠的胚胎细胞中发生翻译[19]。但上述技术仅能提示核糖体所在的位置，而不能证明正在进行的翻译；同时，该方法也不能把失效的核糖体和激活的核糖体区分开来。为避免上述问题，Guttman等[29]发明了核糖体释放积分（RRS）算法，该方法是通过测定ORFs末端的终止来鉴定具有蛋白编码功能的转录本。核糖体印记技术忽视了终止密码子的重要性，而RRS予以了弥补。
同样，为克服核糖体印记技术的上述缺点，有研究者利用翻译的一个重要特性，即一条mRNAs同时具有多个核糖体进行翻译来鉴定RNAs是否具有编码功能，同时他们在已知的编码序列上观察到了RPFs来计算ORFscore[18]。该值反应的是活化的核糖体逐步翻译的过程，因而能鉴定出具有翻译功能的RNAs。通过该方法，其从石斑鱼已知lncRNAs中鉴定出6种小型的ORFs。You等[30]利用上述核糖体印记技术验证来自海马神经组织的circRNAs是否具有翻译的功能，通过检测RPFs是否有与circRNAs环状连接部位的序列相一致情况，如果有，则提示circRNAs具有翻译功能。但结果却是阴性的，表明circRNAs在神经组织中可能不能翻译出蛋白质。随着该技术的不断创新和改进，其完全有可能作为鉴定circRNAs是否具有翻译功能的主要方法之一。
众所周知，一段可以在体外被翻译的RNA序列，在体内环境下相同的过程不一定会发生。为确定circRNAs在体内是否具有翻译功能，体外转录翻译体系可被用于评价该circRNAs是否能够产生多肽链。同时，该体外翻译体系产生的片断可被用于制备抗体，然后通过免疫组化、Western Blot等方法鉴定在体内环境下该circRNAs的翻译情况。质朴分析是目前探测不同组织多肽的主要方法，然而，其本身的局限性使得不易测得小于10 ku的片段，同时由于数据库中缺乏未注释转录本多肽链信息以及质朴分析本身有限的敏感性，使得其对基因翻译潜能的检测能力一般[31]。
到目前为止，尚没有用于系统搜索具有指导蛋白合成功能的circRNAs数据库。但是，中国研究人员已率先建立了名为"circRNADb"数据库，该数据库主要收录了已发现人类的circRNAs信息，其中包含通过质谱分析鉴定出的来自37个基因的46个circRNAs相关蛋白质。随着研究的不断深入，数据的不断更新，其有可能成为获取circRNAs是否具有蛋白编码能力的主要数据库之一[32]。除该数据库外，尚存在很多生物信息学工具，可辅助鉴别circRNAs是否具有蛋白翻译功能，包括:①ORF Finder，其是一个图形的序列分析工具，分析并找到用户提供的或PubMed中已存在序列的ORFs，然后使用标准的或其他特殊的遗传密码子列出所有可能的ORFs，并推导出氨基酸序列。②Pfam 29.0，其是通过寻找circRNAs上的ORFs理论产物在相关蛋白组序列中的同源性来鉴别是否具有翻译的潜能。同时，同源性的蛋白质可为circRNAs的功能研究提供思路[33]。③PhyloCSF，其是通过鉴定circRNAs序列进化保守的特性来评判是否具有编码蛋白的功能，通过搜索同义密码子、保守氨基酸及其替代物的出现频率来鉴别circRNAs的进化保守性[34]。④CircInteractome，该方法通过判断circRNAs是否含有已被验证过的IRES来评价其是否具有潜在的翻译能力。同时，该工具还能搜索人类circRNAs与RNA结合蛋白和miRNAs结合的可能性，为其功能研究提供思路[35]。有研究者通过该方法鉴定出hsa_circ_0041407包含有一个IRES及MAX网络转录抑制子的部分编码序列，可翻译出一个约为31 ku的蛋白片段。通过使用该工具，研究人员可设计跨结合区域的启动子来探测感兴趣的circRNAs以及小干扰RNAs来沉默circRNAs。通过综合运用现有的数据，表明以上工具具有分析circRNAs在体内外是否具有翻译潜能的能力。
circRNAs的蛋白翻译功能尚存在争议，争议的解决尚有诸多的挑战，主要包括①检测一个circRNAs是否具有蛋白翻译潜能需要基因的所有信息。②需要更加准确、快速以及可信的生物信息学工具来分析circRNAs序列。③生物合成方面的进步可增强质谱分析，测序方面的进步可确认circRNAs来源多肽的存在。相信不久的将来，随着研究的深入，生物信息学工具的不断创新，circRNAs翻译能力及翻译产物生物学功能的研究会取得重大进步。
所有作者均声明不存在利益冲突
