观察人牙周膜干细胞（hPDLSCs）成骨分化规律，初步探讨EZH2抑制剂DZNeP对hPDLSCs成骨分化的表观遗传调控作用。
分离和培养hPDLSCs，采用噻唑蓝比色法检测其在不同浓度DZNeP（0、1、2、5、10 μmol/L）作用下的增殖情况，碱性磷酸酶（ALP）染色和茜素红染色观察DZNeP对hPDLSCs成骨分化的影响，免疫荧光染色检测DZNeP对hPDLSCs组蛋白H3K27三甲基化的影响。
与对照组相比，hPDLSCs经1、2、5、10 μmol/L的DZNeP作用48 h后，细胞增殖能力明显减弱（均P<0.05），且呈浓度依赖性。ALP染色和茜素红染色结果显示，DZNeP对hPDLSCs成骨早期标志物ALP的表达及成骨晚期矿化结节的形成均具有促进作用。免疫荧光染色结果显示，与对照组相比，DZNeP组hPDLSCs组蛋白H3K27三甲基化荧光强度明显减弱。
EZH2抑制剂DZNeP对hPDLSCs增殖有抑制作用，在体外可促进hPDLSCs向成骨方向分化，提示DZNeP可作为治疗牙周炎的潜在小分子药物用于临床转化。
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近年来研究结果发现，牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）可在体外分离培养，并具有向成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞等多向分化的能力，将其与生物材料植入体内可形成牙周膜牙骨质复合样结构，因此PDLSCs的临床应用对牙周组织再生具有重要意义[1,2]。研究人员发现，表观遗传因子在细胞命运决定中发挥着不可或缺、至关重要的作用。多梳蛋白家族（polycomb-group proteins，PcG）是重要的表观遗传修饰因子，通过组蛋白修饰和改变染色质构象维持基因转录沉默[3]。PcG蛋白抑制复合物主要分为两类——多梳蛋白抑制复合物1（polycomb repressive complex 1、PRC1）和多梳蛋白抑制复合物2（polycomb repressive complex 2，PRC2），其中PRC2的核心成员包括EZH2、EED和SUZ12[4]。PRC2通过EZH2的SET结构域催化靶基因核小体组蛋白H3的第9、27位赖氨酸二甲基/三甲基化的去甲基化修饰，使转录基因沉默。EZH2在细胞干性维持和谱系发育中起重要作用，参与多种生理过程，如肌肉、脂肪、骨、神经、造血、淋巴和肝细胞生成等[5,6,7]。文献报道，EZH2在肿瘤细胞中常过表达，表明EZH2与肿瘤发生也有着密切联系[8,9]。而EZH2抑制剂DZNeP（3-deazaneplanocin A）是一种有效的PRC2活性抑制剂，可影响肿瘤干细胞的自我更新和肿瘤发生[10]。
目前，关于EZH2在人牙周膜干细胞（human PDLSCs，hPDLSCs）中的表达研究尚未见报道，EZH2对hPDLSCs增殖及成骨分化的作用与人牙髓干细胞有何异同仍属未知。本研究旨在通过体外实验观察EZH2广谱抑制剂DZNeP对hPDLSCs增殖的影响，并进一步研究DZNeP对hPDLSCs成骨分化的影响，以初步分析和探讨EZH2对hPDLSCs的表观遗传调控作用，为筛选潜在的牙周炎治疗药物提供实验基础。
DMEM培养基、胎牛血清（美国Thermo Fisher Scientific公司），双抗（青霉素-链霉素混合溶液，100×）（美国Life Technologies公司），DZNep（美国Adooq Bioscience公司），噻唑蓝（上海昂一生物科技有限公司），碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、茜素红、地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C、Ⅰ型胶原酶（美国Sigma-Aldrich公司），小鼠抗人组蛋白H3K27三甲基化（H3K27me3）多克隆抗体（美国CST公司），Alexa Fluor® 647标记的兔抗小鼠IgG抗体（美国Abcam公司），磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）（北京索莱宝科技有限公司）。选取于天津医科大学口腔医院口腔颌面外科门诊就诊，因正畸需要而拔除的无龋、无根尖周病、无牙周病的12~16岁青少年双尖牙用于体外分离培养hPDLSCs。本研究经天津医科大学口腔医院伦理委员会批准，入选患者均签署知情同意书。
DMI3000 M倒置显微镜（德国Leica公司），Axio-Imager_LSM-800激光扫描共聚焦显微镜（德国Carl Zeiss公司），SynergyTM Mx多功能酶标仪（美国BioTek仪器有限公司）。
使用含双抗（青霉素100 U/ml、链霉素100 μg/ml）的无菌生理盐水反复冲洗双尖牙，刮取牙根中1/3的牙周膜组织；加入3 ml质量浓度为2 g/L的Ⅰ型胶原酶，37 ℃振荡50 min；加入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基，以300× g离心10 min；弃上清，用1.5 ml含有双抗和体积分数为20%胎牛血清的DMEM培养基重悬沉淀后平铺于35 mm直径的培养皿中，于37 ℃、5%CO2条件下培养。
取1 mg DZNeP溶于3.347 5 ml浓度为0.01 mol/L的无菌PBS中，滤菌器过滤收集至15 ml无菌离心管内，用二甲基亚砜将其梯度稀释为10、5、2、1 μmol/L的工作液，置于4 ℃冰箱备用。
取生长良好的第4代hPDLSCs，采用质量浓度为2.5 g/L的胰蛋白酶常规消化后接种于96孔培养板中，每孔加入100 μl DMEM完全培养基（含100 U/ml青霉素、质量浓度为100 μg/ml链霉素和体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基）进行培养；待第2天接种细胞贴壁后，更换培养液，分别加入2 μl含DZNeP终浓度为1、2、5、10 μmol/L的DMEM完全培养基，对照组加入不含DZNeP的DMEM完全培养基，继续培养48 h；每孔加入10 μl噻唑蓝溶液，继续孵育4 h；采用多功能酶标仪测定各孔于490 nm处的吸光度值，以时间为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制细胞生长曲线。
成骨诱导培养液的配制：向DMEM完全培养基中加入终浓度为10 mmol/L的β-甘油磷酸钠、10 nmol/L的地塞米松和终质量浓度为50 mg/L的维生素C。
由噻唑蓝实验结果分析得出DZNeP的最适浓度为5 μmol/L。取生长良好的第3代hPDLSCs，采用质量浓度为2.5 g/L的胰蛋白酶常规消化后接种于12孔培养板中，每孔加入1 ml DMEM完全培养基进行培养。当细胞生长融合达80%~90%时，分为2组，实验组改用含1、2、5 μmol/L抑制剂DZNeP的成骨诱导培养液，对照组采用不含抑制剂的成骨诱导培养液，于37 ℃、5%CO2条件下继续培养。
成骨诱导7 d后，吸弃培养基，PBS洗2次；加入2 ml含体积分数66.3%丙酮和8.16%甲醛的固定液室温固定5 min，吸弃固定液，纯水洗2次；加入2 ml ALP染色液，室温避光孵育15 min，吸弃染色液，PBS洗2次，于倒置显微镜下观察并拍照。
成骨诱导14 d后，吸弃培养基，PBS洗2次；加入体积分数为70%的乙醇固定液，于4 ℃冰箱固定1 h，纯水洗2次；加入浓度为40 mmol/L的茜素红溶液（pH4.2）室温染色1~10 min，肉眼观察着色情况，待着色后用双蒸水洗5次，终止反应，于倒置显微镜下观察并拍照。
将细胞爬片置于6孔板中，以2×104个/cm2的密度接种第3代hPDLSCs，于37 ℃、5%CO2条件下培养。待细胞生长融合达80%~90%时，实验组加入含5 μmol/L抑制剂DZNeP的成骨诱导培养液，对照组加入不含抑制剂的成骨诱导培养液，继续培养3 d后进行免疫荧光染色。用PBS洗玻片3次，每次3 min；用体积分数为4%的多聚甲醛固定爬片15 min，PBS浸洗3次，每次3 min；加入体积分数为0.5%的Triton-X100室温透化20 min，PBS浸洗爬片3次，每次3 min；吸干PBS，加入封闭液室温封闭30 min；弃封闭液，加入小鼠抗人H3K27me3多克隆抗体（稀释比例为1∶100），于湿盒中4 ℃孵育过夜；用含体积分数为0.5%吐温20的PBS（PBST）洗爬片2次，每次3 min；吸干多余液体后加入Alexa Fluor® 647标记的兔抗小鼠IgG抗体（1∶200），于湿盒中室温孵育1 h，PBST洗3次，每次3 min；滴加4′，6-二脒基-2-苯基吲哚避光孵育5 min，PBST洗3次，再用纯水迅速清洗1次，以去除多余盐分；最后加入封片剂封片，于激光扫描共聚焦显微镜下观察并拍照。
使用SPSS19.0统计学软件处理数据，符合正态分布的计量数据采用均值±标准差（Mean±SD）表示，计量数据多组间比较采用方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。
体外培养7~10 d，倒置显微镜下可见组织块边缘有细胞开始游出，细胞呈克隆性生长，形态呈长梭形或多角形，有明显的细胞分叉，胞突细长，胞体丰满，胞质均匀透明，中央有圆形或椭圆形胞核，细胞呈放射状、漩涡状排列（图1）。
噻唑蓝实验结果显示，不同浓度的抑制剂DZNeP（1、2、5、10 μmol/L）作用48 h后，对hPDLSCs增殖均具有明显的抑制作用，与对照组比较差异均具有统计学意义（均P<0.05），其中5 μmol/L的DZNep对hPDLSCs细胞增殖的抑制作用最强，这为后续实验的药物浓度选择提供了依据；不同浓度的DZNeP组之间比较，差异亦均具有统计学意义（均P<0.05）；在1~10 μmol/L范围内，随着DZNeP浓度的增加，测得的吸光度值逐渐减小，即DZNeP的抑制增殖作用具有明显的浓度依赖性（图2）。
与0 μmol/L DZNeP组比较，aP<0.05
成骨诱导7 d后，对抑制剂组和对照组的hPDLSCs进行ALP染色，肉眼观察可见抑制剂组着色较对照组深，倒置显微镜下可见抑制剂组较对照组hPDLSCs胞质中有更多的蓝色着色，且着色基本均匀一致（图3）。
成骨诱导7 d后，两组hPDLSCs逐渐汇合成铺路石状，且随着诱导时间的延长，局部细胞呈重叠生长，间充质逐渐堆积、间充质中矿盐沉积，形成多个结节，并逐渐融合。
成骨诱导14 d后，肉眼可见两组培养板底部均有散在的沙粒样乳白色结节，大小不一，且换液后不能去除。茜素红染色后于倒置显微镜下可见乳白色结节被染成橘红色，提示为矿化结节，且5 μmol/L DZNeP组沙粒样结节最多，着色程度明显高于其他3组，而对照组矿化结节较少（图4）。
成骨诱导3 d后，免疫荧光染色结果显示，对照组hPDLSCs细胞核组蛋白H3K27me3呈阳性表达（红色荧光），而5 μmol/L DZNeP组hPDLSCs组蛋白H3K27me3的荧光强度较对照组明显减弱（图5）。
EZH2是PcG基因家族的核心成员之一[11]，通过表观遗传学修饰对健康的胚胎发育进行监管及维护基因的分化与表达[12]。EZH2在细胞干性维持和谱系发育中扮演着重要角色，通过控制靶基因转录调节细胞定向分化，对肌肉、神经[13]、骨与软骨[14]、造血[15]、脂肪[16]、淋巴[17]和肝细胞生成[18]及上皮分化[19,20]等多种生理过程均具有重要调控作用。
EZH2的另一个重要作用是参与细胞增殖。文献报道，EZH2在正常组织中呈低表达或不表达，而在多种恶性肿瘤中呈高表达，提高EZH2的表达能促进肿瘤细胞生长及浸润，其在肿瘤中的表达水平与肿瘤的侵袭性相关[21]。目前已发现EZH2可参与多种肿瘤的发生发展，如前列腺癌、乳腺癌[22]、肝癌[23]、胃癌[24]、脑肿瘤和恶性胶质瘤等[25,26,27]。因此，研究EZH2在肿瘤发生发展过程中的信号网络和调控机制有望为癌症靶向治疗提供新靶点。
EZH2还参与间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）分化，包括骨生成、脂肪生成和神经形成等[28,29]。全基因组EZH2基因芯片研究结果显示，EZH2与肌细胞增强因子2结合后可与转录抑制因子MITR相互作用，从而抑制EZH2在脂肪细胞中的表达。MITR可与成骨细胞细胞核中的过氧化物酶体增殖剂激活受体γ-2（PPARγ-2）相互作用，促进MSCs成骨分化，抑制MSCs成脂分化，从而阻断PPARγ-2的转录活性，导致脂肪生成减少，骨生成增多[30]。在骨生成中，EZH2的Thr487被SDK1磷酸化，破坏了EZH2与PRC2其他亚基如SUZ12和EED的结合。因此，当EZH2甲基转移酶活性被抑制时，MSCs可分化为成骨细胞。上述研究结果表明，调节EZH2磷酸化可控制MSCs谱系定向分化。通过激活Wnt/β-catenin信号通路可抑制脂肪生成，而EZH2可直接与Wnt-1、Wnt-6、Wnt-10a和Wnt-10b启动子结合，抑制Wnt基因和Wnt/β-catenin信号通路，从而促进脂肪生成。
此外，EZH2还参与牙髓再生。感染牙髓组织和人牙髓细胞均可使EZH2和组蛋白H3K27me3表达降低，KDM6B表达升高[8,19,31]。KDM6B是一种特异性H3K27me3去甲基化酶[32]。EZH2的抑制剂DZNeP可抑制炎症反应相关因子包括白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6和IL-8的mRNA表达，阻碍人牙髓干细胞成脂分化，增强人牙髓细胞成骨诱导相关基因ALP、OSX和BSP的表达[33]。
本研究结果显示，1、2、5、10 μmol/L的DZNeP作用48 h后，对hPDLSCs增殖均具有抑制作用，其中DZNeP浓度为5 μmol/L时抑制增殖作用最强，且DZNeP的抑制增殖作用具有明显的浓度依赖性。成骨诱导7 d后，ALP染色结果显示抑制剂组较对照组hPDLSCs胞质中有更多的蓝色着色。成骨诱导14 d后，茜素红染色可见矿化结节的形成，且5 μmol/L DZNeP组沙粒样结节最多，着色程度明显高于其他3组，而对照组矿化结节较少。上述结果提示EZH2可能促进hPDLSCs成骨分化，这为牙周组织再生提供了新思路。此外，笔者还发现成骨诱导3 d后，5 μmol/L DZNeP组hPDLSCs组蛋白H3K27me3的免疫荧光强度较对照组明显减弱。
综上所述，DZNeP对hPDLSCs增殖具有抑制作用，对hPDLSCs成骨分化具有促进作用，其作用可能与DZNeP抑制EZH2活性、降低H3K27甲基化水平，从而促进成骨相关基因转录有关。本研究结果提示EZH2抑制剂可能作为潜在的治疗药物促进牙周组织再生，但需进一步进行机制和动物实验验证。
所有作者均声明不存在利益冲突
