探讨胸苷激酶1（TK1）、癌胚抗原（CEA）、糖类抗原（CA）19-9、CA15-3和CA72-4在结直肠肿瘤中的表达及临床意义。
采用酶联免疫吸附测定（ELISA）法和电化学发光免疫分析（ECLIA）法分别测定了124例结直肠癌患者、52例结直肠癌前病变患者、154例结直肠良性病变患者、106例健康体检者的血清TK1水平和血清CEA、CA19-9、CA15-3、CA72-4的水平。分析结直肠癌患者血清TK1和其临床病理特征之间的关系。探讨TK1、CEA、CA19-9、CA15-3和CA72-4单独检测与联合检测对结直肠癌的诊断效能。
结直肠癌患者的血清TK1表达水平与肿瘤分期、分化程度、淋巴结转移、远端转移及年龄相关（均P<0.05），但与患者性别无关（P>0.05）。在结直肠癌、癌前病变、良性病变和健康者中，血清TK1水平依次降低。TK1高表达的结直肠癌患者，其生存期更短。多标志物的联合检测的敏感性、特异性和准确率分别为93.5%、93.0%和93.1%。
血清TK1有望成为结直肠癌诊断及预后预测的独立标志物。TK1、CEA、CA19-9、CA15-3和CA72-4的联合检测具有结直肠癌诊断的临床意义。
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结直肠癌作为高发的恶性肿瘤，在2018年全球新发的1 810万例恶性肿瘤中占6.1%，却造成了9.1%的肿瘤死亡病例。发达国家中，结直肠癌的平均发病率为30.3例/10万人（列肿瘤第3位），死亡率为12.8例/10万人（列肿瘤第4位）；发展中国家中，结直肠癌的平均发病率为8.4例/10万人（列肿瘤第4位），死亡率为5.7例/10万人（列肿瘤第5位）[1]。2015年，我国结直肠癌发病率为28.2例/10万人（列肿瘤第3位），死亡率为13.61例/10万人（列肿瘤第5位），其中城市人口比农村人口有更高的发病率和死亡率[2]。
随着生活水平及城市化率的提高，我国结直肠癌的发病率及死亡率逐年升高，因此寻找结直肠癌的特异性标志物，以便对其早期诊治显得尤为重要。胸苷激酶（thymidine kinase，TK）是一种参与DNA合成的细胞酶，分为TK1和TK2。TK1存在于分裂细胞的细胞质中，而TK2位于不增殖细胞的线粒体内[3]。TK1被认为是一种反映肿瘤增殖的生物学标志物，其参与细胞增殖的核苷酸回收途径，在增殖细胞和恶性肿瘤细胞中高表达[4,5]。研究结果表明，TK1的高表达与肿瘤的分期、分级和大小有关[6]。由于TK1几乎不存在于静态细胞中，它被用于监测肿瘤的预后和治疗效果[7]。目前，TK1已被用于早期宫颈上皮内瘤变及早期肺癌的诊断[8,9]。临床上，癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、糖类抗原（carbohydrate antigen，CA）19-9、CA15-3和CA72-4已被用于结直肠肿瘤的诊断，以提高诊断敏感性和特异性。本研究中，评估TK1水平与结直肠癌患者临床病理特征及预后的关系，并探讨TK1、CEA、CA19-9、CA15-3和CA72-4在结直肠肿瘤中的表达及其临床意义。
选择2017年1月1日至2018年4月30日在天津医科大学第二医院就诊的124例结直肠癌患者，其中男70例，女54例，年龄（63.33±7.88）岁。所有结直肠癌患者均行根治手术切除，按照中国结直肠癌诊疗规范进行治疗，并排除合并干扰性疾病因素。统计所有结直肠癌患者的TK1水平，收集患者的性别、年龄、临床分期、淋巴结转移情况、远端转移情况、肿瘤分化程度等信息。对所有结直肠癌患者进行电话随访，随访截止日期为2020年4月30日或患者死亡日期。
选择同时期在天津医科大学第二医院就诊（或查体）的52例结直肠癌前病变患者，其中男30例，女22例，年龄（64.19±8.18）岁，其病理表现为高级上皮内瘤变、锯齿状腺瘤；154例结直肠腺瘤样息肉患者，其中男80例，女74例，年龄（63.88±6.37）岁，其病理表现为管状腺瘤、绒毛状管状腺瘤、炎性息肉；106名中老年健康受试者（年龄范围为50~80岁），其中男62名，女44名，年龄（63.36±7.36）岁，所有健康受试者的体检报告均未见严重的感染或疾病。所有入组者均签署知情同意书。
胸苷激酶1(TK1)细胞周期分析试剂盒（华瑞同康生物技术有限公司）。Immulite 2000全自动化学发光免疫分析仪（德国西门子公司）。
采用单盲法随机分组。其中，106名健康受试者入健康组，154例结直肠腺瘤样息肉患者入良性组，52例结直肠癌前病变患者入癌前病变组，124例结直肠癌患者入结直肠癌组。上述4组中，入组者的性别及年龄等的差异无统计学意义（均P>0.05）。
于清晨采集所有受试者的空腹血样至不含肝素的抽血管中，室温静置30~60 min至血液凝固；以3 500 r/min离心10 min，收集上清液进行酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）。使用TK1细胞周期分析试剂盒并根据试剂盒的使用说明书检测血清TK1水平。检测方法为双抗体夹心法，具体原理为：单克隆抗体TK1制作成固相抗体；于微孔板中加入内含TK1的质控物、校准物、待测样品、TK1酶结合物及TK1结合抗体；适宜温度下培育后，形成抗原及抗体复合物，经过洗涤显色，终止反应后测定450 nm处的吸光度值；该吸光度值与TK1值正相关，通过校准品校准后计算样本的TK1水平。
具体检测步骤为：室温下（约25°）将微孔条固定于板架上并标记；先加入50 μl样品、TK1质控品和TK1校准品，再加入50 μl TK1抗体混匀，留置空白孔；用封口膜封闭条板，在37 ℃下孵育30 min；拿出反应板，去掉其中液体，用洗涤液清洗5次，甩干，小心避免气泡生成；除空白孔外，每孔加入100 μl TK1酶复合物。封闭好后37 ℃孵育30 min；用洗涤液清洗5次；各个孔内依次加入50 μl A、B显色剂，小心混匀，37 ℃下孵育15 min；在各孔内加入终止液50 μl，混匀；采用酶标仪测定450 nm处的吸光度值，再计算出TK1的水平。TK1的正常参考值为0~2.0 pmol/L。
在天津医科大学第二医院核医学科，使用电化学发光免疫分析（electrochemiluminescence immunoassay，ECLIA）法定量测定所有受试者血样中的CEA、CA19-9、CA15-3和CA72-4水平。
CEA、CA19-9、CA15-3和CA72-4的正常参考值分别为0~5 ng/mL、0~37 U/ml、0~35 U/mL和0~6.9 U/ml。
采用SPSS22.0软件进行统计学分析，计量资料以均值±标准差（Mean±SD）表示，两组间比较采用t检验，通过卡方（χ2）检验比较临床病理特征与TK1蛋白表达水平之间的相关性。以P<0.05为差异具有统计学意义。
根据TK1的正常参考值0~2.0 pmol/L，将所有受试者分为TK1阴性组（<2 pmol/L）和TK1阳性组（≥2 pmol/L）。
如表1，结直肠癌患者的血清TK1水平与性别的相关性无统计学意义（P>0.05），但TK1水平与患者年龄、临床分期、淋巴结转移情况、远端转移情况、肿瘤分化程度相关（均P<0.05）。此外，受试者血清TK1水平随结直肠癌患者年龄增大而降低（P<0.05）；Ⅲ、Ⅳ期患者的血清TK1水平高于Ⅰ、Ⅱ期患者（P<0.05）；有淋巴结转移的患者，其血清TK1水平更高（P<0.05）；而低分化或黏液腺癌的患者，其血清TK1水平明显高于中、高分化的患者（P<0.05）。
TK1水平与结直肠癌患者的临床及病理资料的关系
TK1水平与结直肠癌患者的临床及病理资料的关系
| 组别 | 性别 | 年龄 | 分期 | 淋巴结转移 | 远端转移 | 分化程度 | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 男 | 女 | <60 | ≥60 | Ⅰ、Ⅱ期 | Ⅲ、Ⅳ期 | 否 | 是 | 否 | 是 | 中、高分化 | 低分化或黏液腺癌 | |
| TK1阴性（<2 pmol/L） | 28 | 21 | 20 | 29 | 25 | 35 | 17 | 32 | 15 | 25 | 31 | 18 |
| TK1阳性（≥2 pmol/L） | 42 | 33 | 46 | 29 | 17 | 58 | 13 | 62 | 14 | 61 | 23 | 52 |
| χ2值 | 0.016 | 5.001 | 5.959 | 4.870 | 4.907 | 12.811 | ||||||
| P值 | 0.900 | 0.025 | 0.015 | 0.027 | 0.027 | <0.001 | ||||||
注：TK1—胸苷激酶1
血清TK1水平<2 pmol/L和≥2 pmol/L的结直肠癌患者的生存曲线如图1所示。结果表明，TK1水平<2 pmol/L的患者，其生存期明显长于TK1水平≥2 pmol/L的患者（P<0.01），提示TK1可作为结直肠癌患者预后的预测指标。
TK1—胸苷激酶1
各组的血清TK1、CEA、CA19-9、CA15-3和CA72-4水平见表2。结果显示，结直肠癌患者的血清TK1水平最高，癌前病变组其次，良性病变组及健康组最低（均P<0.05）。对于CEA、CA 19-9、CA15-3和CA72-4水平，健康组与癌前病变组及结直肠癌组之间的差异有统计学意义（均P<0.05）；而良性病变组与健康组之间的差异无统计学意义（均P>0.05）。
不同人群的血清TK1、CEA、CA19-9、CA15-3和CA72-4水平
不同人群的血清TK1、CEA、CA19-9、CA15-3和CA72-4水平
| 组别 | n | TK1（pmol/L） | CEA（ng/ml） | CA1-99（U/ml） | CA1-53（U/ml） | CA7-24（U/ml） |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 健康组 | 106 | 1.43±0.62abc | 1.80±0.74abc | 30.01±8.92abc | 31.82±11.57abc | 3.11±0.88abc |
| 良性组 | 154 | 1.50±0.67bc | 2.04±1.08bc | 31.70±8.84bc | 31.68±11.40bc | 3.31±0.86bc |
| 癌前病变组 | 52 | 2.45±0.76c | 3.09±0.93c | 41.05±12.5c | 38.38±12.01c | 7.22±2.61c |
| 结直肠癌组 | 124 | 3.51±1.90 | 9.39±5.85 | 46.10±15.81 | 45.22±14.17 | 9.49±3.87 |
注：TK1—胸苷激酶1；CEA—癌胚抗原；CA—糖类抗原；与良性组比较，aP>0.05；与癌前病变组比较，bP<0.05；与结直肠癌组比较，cP<0.05
TK1、CEA、CA19-9、CA15-3和CA72-4的独立检测和联合检测对结直肠癌的诊断效能见表3。结果显示，联合检测的诊断效能明显高于独立检测，且联合检测的项目越多，敏感性、特异性、准确率越高。
不同标志物的联合检测与独立检测对结直肠癌的诊断效能
不同标志物的联合检测与独立检测对结直肠癌的诊断效能
| 组别 | 真阳性数（n）/敏感性（%） | 真阴性数（n）/特异性（%） | 准确率（%） |
|---|---|---|---|
| CEA | 64/51.6 | 215/68.9 | 64.0 |
| CA19-9 | 58/46.8 | 208/66.7 | 61.1 |
| CA15-3 | 68/54.8 | 168/53.8 | 54.1 |
| CA72-4 | 73/58.9 | 186/59.6 | 59.4 |
| TK1 | 75/60.5 | 201/64.1 | 63.3 |
| CEA+CA19-9 | 98/79.0 | 262/84.0 | 82.6 |
| CEA+CA19-9+CA15-3 | 104/83.9 | 269/85.9 | 85.6 |
| CEA+CA19-9+CA15-3+CA72-4 | 109/87.9 | 273/87.2 | 87.6 |
| CEA+CA19-9+CA15-3+CA72-4+TK1 | 116/93.5 | 290/93.0 | 93.1 |
注：TK1—胸苷激酶1；CEA—癌胚抗原；CA—糖类抗原
2015年，我国有结直肠癌新发病例49 800例，结直肠癌死亡病例19 100例[10]。早期结直肠癌的症状很隐匿，在结肠镜筛查未普及的背景下，寻找诊断效能高的标志物非常重要。虽然，临床上已发现一些相关的肿瘤标志物，但其敏感性及特异性仍较低。在细胞周期中，TK1在嘧啶脱氧核苷酸的合成中起关键作用。血清TK1检测已被用于多种实体肿瘤的诊断和预后分析，包括肺癌、乳腺癌、结直肠癌[11,12,13]。Weagel等[14]发现结直肠癌患者的血清TK1水平较健康人明显升高，本研究结果与其一致。另有研究结果表明，在结肠癌患者中，TK1只在恶性肿瘤细胞的细胞膜上表达，而在正常细胞的细胞膜上不表达，提示TK1特异性定位于肿瘤细胞膜上。在血液系统肿瘤中，也有类似的发现[15]。癌症患者血清中，TK1的高表达提示TK1可能是一种与肿瘤生长相关的标志物，并可预测其进展情况。本研究中，分析了124例结直肠癌患者的血清TK1水平与其临床病理特征之间的关系。结果表明，TK1可用于结直肠癌患者的早期诊断和肿瘤进展评估。
此前的研究结果表明，部分诊断效能高的肿瘤标志物在肿瘤中表达稳定，尤其在肿瘤细胞的细胞膜上过表达，而在正常细胞或正常组织中低表达[16]。例如，人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）在乳腺癌、结直肠癌、胰腺癌中过表达[17]。对于HER2呈阳性的肿瘤，临床上是通过靶向细胞膜上的HER2来治疗的[17,18]。也有研究者发现，TK1在乳腺癌和结肠癌细胞系中高表达[19,20]。TK1水平升高表明肿瘤增殖活跃。Calzado等[21]发现Ⅱ期非小细胞肺腺癌患者的血清TK1水平高于Ⅰ期患者。Cho等[22]在对胃癌患者进行相关研究后发现，Ⅲ、Ⅳ期患者的TK1水平明显高于Ⅰ、Ⅱ期患者。Wang等[23]发现，对于同等大小的肺癌、胃癌及甲状腺癌肿瘤，TK1水平越高，患者的预后越差。Xu等[24]发现，TK1表达水平与肺癌的病理分期相关。McCartney[25]等则认为血清TK1水平升高是乳腺癌等高恶性肿瘤无法被完整切除的危险因素。
CEA、CA19-9、CA15-3和CA72-4是消化道肿瘤的常见标志物。CEA是一种最早从胚胎和结肠腺癌组织中提取到的糖蛋白，在包括结直肠癌的很多消化道肿瘤中高表达[26]。CEA的优势是判断肿瘤的性质，而非反映肿瘤增生的活跃度[27]。CA19-9是从大肠细胞中提取的糖类蛋白，其对于结直肠癌的诊断特异性较高，但敏感性较差。而CA15-3更多地用于乳腺癌的诊断，但其水平在结直肠癌、胰腺癌等消化道肿瘤中也有不同程度升高。CA72-4用于胃肠道肿瘤诊断时，敏感性较高，但单独作为标志物还不能满足相关肿瘤的临床诊断需求[28]。本研究结果表明，TK1、CEA、CA19-9、CA15-3和CA72-4联合检测的诊断效能较好，敏感性、特异性、准确率分别为93.5%、93.0%和93.1%。
综上，联合检测TK1、CEA、CA19-9、CA15-3和CA72-4可获得较好的结直肠癌诊断敏感度和特异度；较高血清TK1水平，提示更差的预后；血清TK1有望作为一个独立的结直肠癌标志物，其在结直肠癌的临床诊断及预后预测中具有应用潜力。
所有作者均声明不存在利益冲突
