探究浙贝母-金银花药对治疗糖尿病足的作用机制。
通过TCMSP筛选浙贝母-金银花药对的药物成分，使用Swiss Target Prediction预测药物成分的作用靶点，运用GeneCards获取糖尿病足的疾病靶点，利用Venny 2.1获取交集靶点。使用STRING进行蛋白质间作用网络（PPI）分析并使用Cytoscape构建网络图，利用Metascape进行基因本体（GO）及京都基因和基因组百科全书（KEGG）分析。使用Cytoscape软件构建"药物-靶点-通路"网络图。建立糖尿病足大鼠模型并用浙贝母-金银花药对局部外敷治疗患处，观察治疗效果及检测血清筛选靶点表达。
浙贝母-金银花药对中的38个有效成分通过多条通路直接作用于339个疾病靶点治疗糖尿病足，其中木犀草素（Luteolin）、苦叶草素（Picropodophyllin）、天竺葵素（Pelargonidin）、紫鄂贝碱（Ziebeimine）、浙贝乙素（Peiminine）、腺苷（Adenosine）等是核心成分，TP53、EP300、HSP90AA1、CTNNB1、Akt1是至关重要的靶点。基因功能注释分析结果显示，交集基因最可能相关的生物过程主要涉及细胞转录因子结合、细胞对氮化合物反应、激素反应等，细胞组分主要涉及膜筏、质膜筏、小窝等，分子功能主要涉及蛋白激酶活性、磷酸激酶活性、激酶活性等。通路富集分析结果提示浙贝母-金银花药对主要参与PI3K/AKT、HIF-1、EGFR、MAPK等信号通路。浙贝母-金银花药对修复糖尿病足鼠模型的病变部位的效果明显，且血清TP53、EP300、HSP90AA1、CTNNB1、Akt1蛋白表达明显增加。
浙贝母-金银花药对治疗糖尿病足的机制是通过调节PI3K/AKT、HIF-1、EGFR、MAPK等信号通路的TP53、EP300、HSP90AA1、CTNNB1、Akt1等疾病靶点，进而调节酶类活性、抗炎等生物过程。
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糖尿病足（diabetic foot，DF）是指下肢肢体末端周围血管病变和神经病变引起的足部感染、溃疡以及深层组织破坏，是最严重糖尿病慢性并发症之一，也是糖尿病截肢的最主要原因[1]。伴随居民生活水平的提升，糖尿病患者数量逐年增加，糖尿病足的发病率居高不下。50岁以上的糖尿病足患者在治愈后1年内的复发率约为31.6%，截肢者的5年死亡率约40%[2]。糖尿病足给患者造成生理与心理上的双重打击。现代医学认为糖尿病足的发病机制与血糖对周围血管及周围神经损伤相关，同时引起局部分泌炎症介质，诱发神经炎和血管炎症；还与机体代谢紊乱相关，血糖影响糖化血红蛋白、胆固醇及低密度脂蛋白等代谢。现代医学治疗糖尿病足以控制血糖、消炎及局部对症治疗为主，疗效有待进一步提升。中国传统医学对糖尿病足的认识久已有之，积累了丰富的临床诊疗经验，具有调治全面、愈合较快、减少截肢等并发症等显著优势。近代医家将糖尿病足归为"脱疽""痈疽""消瘅"等范畴。在临床上，准确辨识糖尿病足是及早预防、有效治疗的关键，也是保证治疗效果及预后的重要因素[3]。
浙贝母归属于百合科，具有散结清热、化痰止咳的功效，临床上主要用于治疗肺痈喉痹、风热咳嗽、疮疡肿毒和瘰疬等病症[4]。现代医学药理学研究结果表明，浙贝母含有多种药效成分，其主要化学成分包括生物碱类、多糖类、总皂苷类、黄酮类和挥发性成分等，相关成分有止咳祛痰平喘、镇痛抗炎、抗溃疡、抗氧化、抗肿瘤及逆转肿瘤细胞耐药等生物学功能[5,6]。金银花味甘性寒，具有化瘀凉血、解毒清热的功效，临床上主要用来治疗风热外感、疔毒疮疡、热痛红肿、初起瘟病、脓血便等病症[7]。现代药理学研究结果表明，金银花具有多种生物活性成分，其中主要成分包括黄酮类、环烯醚萜、肌酸类、挥发性成分等。黄酮类化合物具有抑制病毒、降血脂、抑制肿瘤因子、抑菌、抗过敏、抗炎等生物学功能；肌酸类化合物具有抑菌、消炎、抑制氧化应激等生物学活性；环烯醚萜化合物具有清热解毒、消炎、缓解疼痛的作用；金银花中的挥发性成分的主要作用是防治咽喉肿痛及抗氧化等[8,9]。
为探索浙贝母-金银花药对在治疗糖尿病足过程中的作用机制，本研究中利用网络药理学方法预测相关作用靶点并分析其作用机制，在此基础上实验验证相关靶蛋白的表达，以期为浙贝母-金银花药对治疗糖尿病足提供理论依据，并为后续的药物研究与开发奠定基础。
清洁级SD（Sprague Dawley）大鼠20只，体质量为350~450 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。浙贝母-金银花药对药物（天津中医药大学第二附属医院)，链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）（美国Sigma公司），肿瘤蛋白p53（tumor protein p53，TP53）、结合蛋白（binding protein p300，EP300）、热休克蛋白90α-A1（heat shock protein 90 alpha family class a member 1，HSP90AA1）、钙粘着蛋白关联蛋白β1（cadherin-associated protein Beta 1，CTNNB1）、Akt1蛋白酶联免疫吸附试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司），其余实验试剂、耗材（中国医学科学院放射医学研究所）。
使用中草药系统药理学平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology，TCMSP）筛选浙贝母和金银花的药物成分及相关靶点。在TCMSP（http://tcmspw.com/tcmsp.php）中分别检索浙贝母和金银花的药物成分，设置口服生物利用度（oral bioavailability，OB）和类药性（drug-likeness，DL）指标为：OB≥30%，DL≥0.18。采用PubChem，下载成分的3D/2D结构。
使用瑞士药物靶点预测（Swiss Target Prediction）数据库（http://www.swisstargetprediction.ch/），获取药物成分的作用靶点（P≥0.12）。用GeneCards（https://www.genecards.org/）检索糖尿病足疾病靶点。用venny2.1（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）获取交集靶点。
将交集靶点导入蛋白质相互作用数据库（Search Tool for Recurring Instances of Neighbouring Genes，STRING)STRING（https://string-db.org/）分析蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction, PPI），设置参数为combined score>0.9。隐去游离靶点，获取PPI图，并将数据输入Cytoscape 3.7.2软件进行分析，最终获得PPI网络图。
利用基因注释与分析资源网站Metascape（http://metascape.org/）分别进行分子功能（molecular function，MF）、生物过程（biological process，BP）、细胞组分（cell component，CC）的基因本体（gene ontology，GO）富集分析及京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）信号通路分析，指标为P<0.01。微生信网站（https://www.bioinformatics.com.cn/）制作GO BP-MF-CC及KEGG富集图。
使用Cytoscape软件构建"成分-靶点-通路"网络图，依据degree scores分析网络中药物核心成分和药物疾病核心靶点。
将20只SD大鼠在适宜温度和湿度环境中饲养1周，采用链脲佐菌素方法建立糖尿病足大鼠模型。方法如下：将按大鼠体质量计算后的链脲佐菌素经左侧腹腔注射，并采用利器在大鼠足部打孔建立糖尿病足大鼠模型。将建模成功的20只糖尿病足模型大鼠随机分入治疗组和对照组，每组10只。治疗组以在糖尿病足患处外敷浙贝母-金银花药对的方式治疗14 d，对照组正常饲养。14 d后，取两组大鼠的血清，采用酶联免疫吸附法检测血清TP53、EP300、HSP90AA1、CTNNB1、Akt1蛋白的表达。所有试验均按照动物伦理规范进行。.
共检索出浙贝母-金银花药对的有效成分45个，其中浙贝母有22个，金银花有23个。经过在线检索分子结构和检索靶点后得到有效药物成分38个。
检索后得到浙贝母-金银花药对的成分作用靶点1 560个，汇总并删除重复值后，共得到559个靶点。从疾病数据库得到4 626个靶点。将药物靶点与疾病靶点取交集，得到浙贝母-金银花药对治疗糖尿病足的作用靶点339个。（图1）
处理分析交集靶点后获得PPI网络，该PPI网络有339个节点和1 550条边，留取分数（degree scores）≥40的靶点制作网络图（图2）。图中靶点大小反映靶点联系紧密程度，认为尺寸较大的靶点是网络的关键靶点。
对药物和疾病的共同靶点进行了GO-BP、GO-CC及GO-MF的富集分析。结果显示，共有相关的生物过程257个、分子功能102个、细胞组分101个。依据log q值降序排列，分别选取BP、CC、MF的前10个代表制作富集图。（图3）
1—蛋白激酶活性；2—磷酸转移酶活性，醇基为受体；3—蛋白质丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性；4—激酶活性；5—蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性；6—蛋白丝氨酸激酶活性；7—激酶结合；8—蛋白激酶结合；9—蛋白质结构域特异性结合；10—转录因子结合；11—细胞对氮化合物的反应；12—细胞对有机氮化合物的反应；13—对激素的反应；14—细胞对有机环状化合物的反应；15—对肽的反应；16—细胞对激素刺激的反应；17—细胞对肽的反应；18—对肽激素的反应；19—细胞对肽激素刺激的反应；20—对胰岛素的反应；21—膜筏；22—膜微区；23—小窝；24—质膜筏；25—树枝状树木；26—枝晶；27—细胞体；28—轴突；29—神经细胞体；30—远端轴突
KEGG信号通路分析共得到信号通路172条，依据log q值由降序排列，选择前20条最相关通路制作富集图。（图4）
由成分-靶点-通路网络图，可知浙贝母-金银花药对中的38个有效成分通过多条通路直接作用于339个糖尿病足靶点，具有多成分、多靶点、多通路的特征。网络中度值≥30的有效成分包括木犀草素（Luteolin）、鬼臼苦素（Picropodophyllin）、天竺葵素（Pelargonidin）、紫鄂贝碱（Ziebeimine）、浙贝乙素（Peiminine）、腺苷（Adenosine）等，这些成分是浙贝母-金银花药对治疗糖尿病足的核心成分（表1）。网络中度值≥20的靶点包括TP53、EP300、HSP90AA1、CTNNB1、Akt1等，这些靶点是浙贝母-金银花药对治疗糖尿病足的核心靶点。
浙贝母-金银花药对治疗糖尿病足的核心成分对照表
浙贝母-金银花药对治疗糖尿病足的核心成分对照表
| 成分名称 | 成分来源 |
|---|---|
| 木犀草素（Luteolin） | 金银花 |
| 鬼臼苦素（Picropodophyllin） | 金银花 |
| 天竺葵素（Pelargonidin） | 金银花 |
| 紫鄂贝碱（Ziebeimine） | 浙贝母 |
| 浙贝乙素（Peiminine） | 浙贝母 |
| 腺苷（Adenosine） | 浙贝母 |
酶联免疫检测结果显示，与对照组相比，治疗组糖尿病足鼠模型的血清TP53、EP300、HSP90AA1、CTNNB1、Akt1的表达量均增加，且差异有统计学意义（均P<0.05）。（表2）
两组大鼠血清TP53、EP300、HSP90AA1、CTNNB1、Akt1蛋白表达（
±s）
两组大鼠血清TP53、EP300、HSP90AA1、CTNNB1、Akt1蛋白表达（±s）
| 组别 | n | TP53（ng/ml） | EP300（ng/ml） | HSP90AA1（ng/ml） | CTNNB1（ng/ml） | Akt1（ng/ml） |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 对照组 | 10 | 40.61±0.58 | 50.73±1.59 | 38.05±0.49 | 32.63±1.84 | 25.76±1.08 |
| 治疗组 | 10 | 49.84±0.73a | 62.25±0.60a | 42.64±0.52a | 49.88±0.71a | 50.27±0.72a |
| P值 | <0.05 | <0.05 | <0.05 | <0.05 | <0.05 |
注：与对照组比，aP<0.05
现代医学认为，糖尿病足是由于糖尿病引起肢体末端中小血管及微循环障碍及周围神经病变，后因机械性损伤和感染所致局部感染。中国传统医学将糖尿病足归属于"消渴""脱疽"等范畴。近些年来，研究者通过总结中医经典著作，认为糖尿病足的主要病机是本虚标实、虚实夹杂。该观点已成为中医对糖尿病足的主流认知。本虚主要以阴虚和气虚为主，标实主要以血瘀、寒凝、热毒、痰湿、气滞为主。然而，一些研究者对于糖尿病足的病机也有不同的观点[3]。方多多等[10]研究糖尿病足络病相关病因病机，发现疾病根本原因在于络脉虚损，而络瘀、络毒是其重要因素，应遵循"以通为用，通补最宜"的原则进行治疗。巴元明等[11]研究认为糖尿病足属"络病-血管系统病"范畴，患者气阴双虚、互结痰瘀及腐邪热毒阻络是糖尿病足发病的基本病机及病理基础。在历代中医治疗糖尿病足的方法中，基于"络以通为用"的原则的化瘀通络法应用最为广泛并占有重要的地位。颜菊等[12]研究叶天士"营血"病机，探索糖尿病足的发病机制及影响因素，认为瘀阻络脉、阴亏营热能导致糖尿病足，是营分证在糖尿病足病机中的前期基本体现，而血瘀热灼、脉络受损而引起的糖尿病足是血分证在糖尿病足后期病程中变化的病机体现。此外，其还研究了玄府在糖尿病足的病机病因变化中所起的作用，认为玄府郁闭不通以及全身的气和津液循环不通畅，会导致肢体末端供给养分不足，从而出现肢体末端病变，即糖尿病足。
浙贝母-金银花药对具有清热散结、活血化痰的功效，符合糖尿病足的中医病机。本研究中，基于网络药理学发现浙贝母-金银花药对中的38个有效成分通过多条通路直接作用于339个糖尿病足相关靶点。浙贝母-金银花药对治疗糖尿病足的核心成分包括木犀草素（Luteolin）、鬼臼苦素（Picropodophyllin）、天竺葵素（Pelargonidin）、紫鄂贝碱（Ziebeimine）、浙贝乙素（Peiminine）、腺苷（Adenosine）等，而TP53、EP300、HSP90AA1、CTNNB1、Akt1是治疗过程中的重要靶点。基因功能注释分析结果显示，交集基因最可能相关的生物过程主要涉及细胞转录因子结合、细胞对氮化合物反应、激素反应等，细胞组分主要涉及膜筏、质膜筏、小窝等，分子功能主要涉及蛋白激酶活性、磷酸激酶活性、激酶活性等。通路富集分析结果提示，浙贝母-金银花药对主要参与PI3K/AKT、低氧诱导因子-1（Hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）、表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）等信号通路。浙贝母-金银花药对外敷糖尿病足鼠模型的病变部位后，局部修复效果明显，其血清TP53、EP300、HSP90AA1、CTNNB1、Akt1蛋白表达明显增加。
现代药理学研究结果已证实浙贝母-金银花药对的药物成分具有抑制细菌、抵抗炎性反应、修复组织损伤等功能。木犀草素能抑制炎症因子和氧化应激反应过程，减少其对机体的损伤[13]，并具有抗炎活性[14]。体外细胞实验结果发现，木犀草素能负性调节细胞炎症因子，如白介素1β（Interleukin-1β）、IL-2、IL-6、IL-8、IL-12、IL-17和干扰素（TNF-α、IFN-β），能正性调节血清炎性细胞因子IL-10的水平。PI3K/AKT信号通路在机体内主要参与调节细胞活化、增殖、代谢、炎症反应和凋亡等生物过程，是非常重要的细胞内通路，PI3K属于脂质激酶家族成员，PI3K磷酸化激活，然后进一步激活下游靶点AKT[15]。郑艳等[16]的研究结果显示，木犀草素通过调节PI3K/AKT/mTOR信号通路来改善心衰大鼠的心室重构，木犀草素通过调节PI3K信号通路对组织重构有一定的调节作用。表皮生长因子受体（epidermal growth factor，EGF）及其受体（EGFR）能调节细胞更新、生长和凋亡，对维持上皮完整性方面有重要作用，研究者发现EGF与EGFR结合能诱使前列腺组织异常增生[17]，表明EGFR在前列腺组织炎症及增生方面有重要作用。HIF是机体缺氧状态下产生的主要调节因子，而HIF-1信号通路在机体缺氧状态下，对机体减少低氧损伤和机体保护中至关重要。最近的研究结果表明，HIF信号通路不仅可以通过降低氧气利用率来诱导一系列的适应性反应，而且在细胞损伤后发挥保护作用，并具有促进多种慢性疾病中细胞恢复的作用[18]。研究结果显示，腺苷能通过与腺苷A2A受体结合，调控PI3K[19]、ERK[20]、p38MAPK[21]等信号通路发挥生物学作用。根据PerezAso[19]的研究结果，腺苷与A2A受体结合并激活后，通过调控PI3K信号通路途径能干预胶原合成。张汝锋等[22]的研究结果显示，腺苷A2A受体拮抗剂能通过调节PI3K通路途径抑制小鼠瘢痕增生，提示腺苷能通过调节PI3K通路途径干预机体组织损伤瘢痕修复，促进创伤修复。李圆等[23]研究了红芪多糖对糖尿病周围神经病变小鼠坐骨神经中MAPK信号通路的影响，证实红芪多糖可通过下调p38MAPK信号通路，改善对糖尿病周围神经病变的炎症反应。HIF在组织修复中起到重要作用。类泛素化和HSP也是调控HIF-1α活性的重要途径。热休克蛋白90（HSP90）可以结合新生成的HIF-1亚基防止其降解。同时，HSP90与接头蛋白（receptor for activated protein C kinase 1，RACK1）竞争PAS结构域中的结合位点，促进HIF-1在胞质中的积聚和蛋白质折叠。
综上所述，浙贝母-金银花药对治疗糖尿病足的疗效显著，作用机制是木犀草素、鬼臼苦素、天竺葵素、紫鄂贝碱、浙贝乙素、腺苷等核心成分通过调节PI3K/AKT、HIF-1、EGFR、MAPK等信号通路，调节TP53、EP300、HSP90AA1、CTNNB1、Akt1靶蛋白，干预酶的活性、炎症反应等生物学过程。
所有作者均声明不存在利益冲突
