胚胎植入前产前诊断技术在辅助生殖中得到了很大发展，特别为遗传物质异常人群提供了优生优育的技术可能。单细胞测序作为新兴的测序技术，可以从单个细胞的层面解析细胞的基因组和转录组等组学问题，能够反映细胞间的异质性，从而有利于揭示疾病发生发展的机制。通过胚胎植入前产前诊断，应用胚胎活检获得的单个细胞进行高通量测序，可有效检出胚胎染色体的整倍性，对单核苷酸多态（SNP）和染色体拷贝数变异（CNV）也有较好的检出作用，可以应用于基因组多态性及致病变异的检测和研究。介绍了单细胞测序技术和方法，总结了单细胞测序在遗传生殖诊断中的研究现状，阐述了该技术在遗传生殖领域的应用进展，探讨了该技术的未来发展方向。
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出生缺陷是指婴儿出生前发生的身体结构、功能以及代谢的异常。出生缺陷通常是严重致残致死性疾病，往往缺乏诊疗手段。除严重胎儿畸形外，出生的缺陷儿中30%会在5岁前死亡，40%的缺陷儿会有终身残疾，给患儿的家庭甚至社会造成了沉重的精神和经济负担[1]。造成出生缺陷的原因很多，主要有遗传因素和环境因素。原卫生部2012年发布的《中国出生缺陷防治报告（2012）》统计，我国出生缺陷高达5.6%，每年新增出生缺陷数约90万例，其中20%~30%与遗传因素相关。目前，已知的属于出生缺陷类的疾病达11 000种以上，其中分子机制已知的表型有6 824种，导致表型的变异基因总数有4 460种（更新至2021.06.26，OMIM）。
在所有出生缺陷中，与遗传因素相关的出生缺陷占80%左右，包括染色体结构异常，单个基因或多基因异常甚至基因甲基化异常等[1,2]。单细胞测序技术已广泛应用于外显子组、全基因组、转录组、DNA甲基化组、组蛋白修饰、染色体质结构、空间转录组等领域，有力地推动了出生缺陷的病因学研究[3]。对于大多数遗传性疾病，目前还没有有效的治疗药物和治愈手段。
单细胞测序技术发展的成熟和临床应用，为遗传性疾病的诊断提供了有力工具，特别是应用在产前诊断和胚胎植入前遗传学诊断/筛查中[4]。单细胞测序技术作为一种较为新兴的技术，可弥补常规高通量技术和方法的不足，尤其是分析生殖细胞嵌合，对卵裂期优质胚胎染色体基因检测，表征胚胎内细胞异质性方面有巨大优势。本文将主要阐述单细胞测序技术及其在遗传生殖领域的应用研究。
单细胞测序技术已被广泛应用在临床和科学研究的各个领域，包括肿瘤研究、血液系统疾病、辅助生殖、罕见病研究等领域。本文对目前已应用的单细胞测序方法进行简要综述。
单细胞基因组测序（single cell genome sequencing，scDNA-seq）指在单个细胞水平上对其携带的遗传信息进行扩增和测序的一项技术。该技术首先要获得单个细胞，之后对单个细胞的全基因组进行扩增（whole genome amplification，WGA）。
目前常用的单细胞分离方法有显微操作法[5,6]、激光捕获显微切割法[7]、荧光活化细胞分选法[8]、磁活化细胞分选法[9]、微流控分选法[10,11,12,13]等技术。WGA主流的应用技术有3种，包括简并寡核苷酸引物聚合酶链反应（degenerate oligonucleotideprimer polymerase chain reaction，DOP-PCR）[14]、多重置换扩增法（multiple displacement amplification，MDA）[15]、基于多个退火和循环的扩增循环法（multiple annealing and looping-based amplification cycles，MALBAC）[16]以及转座子插入的线性扩增法（linear amplification of transposon insertion，LIANTI）[17]。单细胞测序对染色体拷贝数变异（copy number variation of chromosomes，CNV）的检测准确性高，对单个碱基变异（SNP）检测的准确性依然存在挑战。
单细胞转录组测序通常称为单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq），用于解析复杂生物系统中单细胞水平的细胞类型差异和基因表达谱。对发现细胞间异质性、新细胞类型、新生物标志物方面有较明显优势。常用的单细胞转录组测序技术方法有Smart-seq2法[18]、CEL-seq法[19]、Quartz-seq法[20]、STRT-seq法[21]、Drop-seq法[22]等技术。随着单细胞转录组测序技术的逐渐成熟与测序成本的逐步降低，会有越来越多的实用技术应用到科学研究和医学临床实践中。
在遗传背景相同的情况下，通过DNA的甲基化来调控生物发育进化过程，参与生物功能的开启或者关闭，控制细胞的命运。组织水平的DNA甲基化研究是建立在群体细胞水平上的，掩盖了细胞之间的差异及少数关键细胞类型的作用。单个细胞水平DNA甲基化的研究，为深入了解生物发育过程，特别是为胚胎早期发育、疾病进展、衰老、肿瘤早期形成提供重要手段[23]。目前常见的单细胞表观遗传测序技术包括scCOOL-seq法[24]、CoBATCH法[25]。CoBATCH法将染色体片段化和PCR接头添加过程一步完成，提高了染色体免疫共沉淀技术（ChIP）[26]的效率，用组合标签的方法对单细胞进行标记，该方法是目前最先进、最高效的ChIP-seq技术。
有学者于2004年提出了单细胞蛋白质组分析技术，因为单细胞内蛋白种类较组织中少，不同蛋白的丰度差异大，且很多重要蛋白丰度低，又不能通过扩增技术扩增等原因，造成了单细胞蛋白质组分析难度大。常用的分析技术包括PLAYR技术[27]、CITE-seq技术[28]、REAP-seq技术[29]。通过同位素或寡核苷酸标记抗体，表征特定蛋白质和RNA，通过分析同位素或者寡核苷酸标记蛋白来反应蛋白表达水平。
空间转录组学（Spatial transcriptomics）是指在组织切片上完成，保留样本空间信息的组学研究。空间转录组可展示组织切片中不同区域的基因表达情况，揭示精细病理区域中激活的信号通路，完成分子特征驱动病理特征的机制解析。空间转录组学完成了病理数字化结合病理影像化的技术革新，对于诊断标志物、耐药位点以及靶向药物的研发，以及免疫治疗等新兴领域都具有重要作用[30]。
胚胎植入前单体型分析（preimplantation genetic haplotyping，PGH）是胚胎植入前基因检测技术（preimplantation genetic testing，PGT）中常用的一个方法，是利用短串联重复序列（short tandem repeat，STR）在DNA复制过程中会发生一个或几个单位的重复或缺失的特点，在人群中的重复次数会体现个体的差异，进行家系分析可确定染色体变异，其最大的优势是该技术能发现单基因病甚至己确定的基因缺失；但需在进行PGH分析之前，需仔细研究至少一个致病基因连锁的个体，并找到一些能用于携带者标记的连锁标记。2006年，Renwick等[31]成功用MDA产物通过PGH方法应用于囊性纤维变性和杜氏肌营养不良症（Duchenne muscular dystrophy, DMD）并使受孕。目前，PGH应用了将荧光标记在PCR扩增引物上的荧光PCR，并通过荧光电泳进行单体型分析，大大缩短了PGH的时间，作为一种代替诊断的方法，PGH增加了PGT诊断的范围和可用性。
单核苷酸多态（single nucleofide polymorphism，SNP）在人类基因突变中占有很大比例，SNP可能与人类某些疾病的发生发展相关。因此，SNP作为基因组关联分析标记被研究者关注；但单细胞SNP关联分析需要足量的基因组DNA，而WGA使之成为可能。WGA之后的SNP分析不仅提供了一种可靠的评估DNA产品的方法，同时在探究染色体畸变实验中也呈现出高精确性和可重复性，2009年，Ling等[32]通过MDA结合SNP分析的方案，成功发现了单体和三体的染色体数目畸变。WGA结合SNP方案尚处在发展的初级阶段，之后的发展不可估量。
陈雯等[33]通过等位基因映射识别技术（mapping allele with resolved carrier status，MaReCs）对染色体平衡易位携带者胚胎易位携带情况进行检测，可帮助携带者筛选出完全正常的胚胎，减少平衡易位向子代传递的可能。但确定参照胚胎是技术流程中的关键点，参照胚胎应携带至少一个遗传自易位携带者的异常等位基因，而且其异常核型必须对应唯一的CNV模式图谱。对于无参照胚胎的情况，可再次促排卵，对获得的所有胚胎（包括发育停滞的胚胎）进行检测，一旦找到可用的参照胚胎，确定断裂点，即可回顾性检测分析前次的扩增产物，鉴别胚胎的易位携带状态。
有研究者开发的应用Nanopore平台对单细胞扩增RNA全长测序的技术（single-cell amplification and sequencing of full-length RNAs by Nanopore platform，SCAN-seq），相比于二代测序平台该技术更为敏感和精准。通过对小鼠胚胎单细胞的研究，发现来自9 338个基因27 250个未注释的转录本，可清楚地分析胚胎发育的各个阶段。SCAN-seq技术可高准确度识别个体细胞间特定等位基因的表达情况[34]。
DNA甲基化在哺乳动物胚胎发育过程中起到至关重要的表观遗传调节作用，有学者通过对人类植入前胚胎单细胞DNA甲基化测序发现，数以万计的新位点被甲基化。在胚胎发育过程中，全基因组DNA甲基化重新编码是剧烈的全局去甲基化和显著的再甲基化动态平衡的过程，而且父源的去甲基化过程比母源的更快且彻底。从受精卵分裂成两细胞到胚胎移植后期，父源的甲基化水平始终低于母源的甲基化水平[35]。
有学者使用单细胞RNA测序来寻找人类、猕猴和小鼠睾丸生殖细胞和体细胞的转录特征。揭示了整个精子发生过程中表达的相似性和差异性，包括精原细胞的干/祖池、分化标志分子、减数分裂的潜在调控因子、精子分化过程中的RNA转换以及生殖细胞-体细胞之间的信息通信。这些数据为今后灵长类生殖细胞发育和配子体形成的靶向机制研究提供了基础[36]。
杜氏肌营养不良症（DMD）是一种神经肌肉系统常见的X-连锁隐性遗传病。通过胚胎植入前遗传学诊断可筛选正常的胚胎移植，以防止DMD异常妊娠的发生。通过MDA的全基因组扩增技术对4个DMD家系完成了PGT的诊断，筛选出了正常的胚胎并进行移植，防止了遗传学异常妊娠的发生，避免了反复流产、引产对孕妇及其家庭造成的伤害[37]。
有研究者应用非整倍体测序和连锁分析检测突变等位基因技术（mutated allele revealed by sequencing with aneuploidyand linkage analyses，MARSALA），同时检测79例马凡氏综合征及其可疑者的变异位点、染色体非整倍体以及胚胎连锁状态，对符合条件的患者进行了PGT检测。该技术流程首先通过包含124种表型相关的基因Panel筛查可能致病位点，共筛查出7组夫妇携带明确致病变异，并进行随后的MARSALA-PGT检测，对染色体结构正常和/或不携带突变位点的胚胎进行移植。5组夫妇进行了随后的胚胎移植，4例在孕20周左右进行了产前诊断，检测结果均为正常胎儿，阻断了马凡氏综合征的向下传递[38]。该团队基于MARSALA技术又对两组曾生育过脊髓性肌萎缩症（spinal muscular atrophy，SMA）患儿的孕妇进行了PGT检测。结果，其中一对夫妇生下了一个健康的婴儿，没有携带SMA的基因突变。该技术可准确地区分杂合缺失和野生型胚胎；另外，当无法获得先证者标本时，通过连锁分析可确定先证者，再通过直接突变测序，可识别出异常的胚胎[39]。
该团队应用单细胞RNA测序技术分析了来自正常精子产生供体的2 854个睾丸细胞和来自非阻塞性无精子症供体的174个睾丸细胞，建立了不同时期的精子发生细胞亚型，找到了几个人类生殖细胞特定阶段的标志分子，例如HMGA1、PIWIL4、TEX29、SCML1和CCDC112。并分析了一位非梗阻性无精子症患者的基因表达模式，对进一步解读男性生殖障碍有一定意义[40]。
有研究者通过收集人受精后Gardner评分5AA的胚胎，显微镜下微吸管分离囊胚内细胞团和滋养外胚层细胞团，进行单细胞测序分析，筛选差异表达基因并进行聚类分析和Gene Ontology功能分类。内团细胞有1 283个基因表达上调，主要功能包括核酸依赖的转录、抗原的相互作用、免疫反应、信号转导、细胞分化、细胞黏连等过程。滋养外胚层细胞有1 073个基因表达上调，包括了细胞周期、蛋白分解代谢、氨基酸的磷酸化和水解、蛋白质细胞内的转运以及糖代谢等生物过程。该研究从空间维度揭示了囊胚内细胞团和滋养层的基因表达情况，为寻找调控胚胎植入的内源性关键性分子提供可能[41]。
有研究者通过比较MALBAC和MDA全基因组扩增法，对β地中海贫血样本的单细胞和多细胞进行植入前遗传学诊断/筛查，以选择最优的全基因组扩增方法。57个携带β地中海贫血突变的成纤维细胞和48个单细胞囊胚样本分别被MALBAC和MDA法扩增，通过低深度高通量测序来评估两种方法在CNV检测中的检出率和等位基因脱扣率。在成纤维细胞单个细胞水平，MALBAC的CNV检出率为100%，而MDA的检出率为91.7%，且MALBAC的脱扣率明显低于MDA法。但当细胞数增加到5个或者更多时，两种方法也就没有明显差异。该研究通过对HBB基因突变的植入前遗传学检测发现，MALBAC更适合在单细胞水平上进行分析，当起始细胞数达到5个或更多时，两种方法表现出形似的有效率和准确性[42]。
胚胎发育是一个被一系列基因准确调控的复杂过程。胚胎早期细胞数量有限，造成了早期胚胎发育研究的困难。单细胞测序技术的应用，不仅可以观察细胞分化过程中细胞的异质性，而且可以揭示不同细胞在发育过程中的基因表达情况。在胚胎植入前产前诊断检测中，常获得的细胞数为单个极体、个别卵裂球细胞或几个滋养层细胞，核酸含量少，而单细胞测序则可很好解决这方面问题。通过对全部基因组序列进行非选择性扩增，在没有序列倾向性的前提下大幅度增加DNA的总量，能很好的解决PGT的标本少和准确性要求高等要求，为后续的胚胎基因诊断提供有力工具。
虽然现阶段单细胞测序技术仍然存在一系列问题，例如：实验时间长，样本要求高，费用高，细胞基因覆盖率低，测序过程存在偏倚，测序结果准确性差等缺点。但随着技术的进步，这些问题将会逐渐得到解决。该技术有望为胚胎早期分化发育谱系研究提供重要依据，也可以为辅助生殖提供更为有力的工具。
所有作者均声明不存在利益冲突
