血小板输注是临床治疗原发或继发性血小板减少、血小板功能障碍等疾病的一项重要措施。随着国家采供血相关法律法规的出台和各种无偿献血政策的推进，血小板制品临床供需矛盾得到了一定缓解。通过成分制备血小板时可根据临床需求进行白细胞滤除、病毒灭活或辐照等处理以降低免疫性输血不良反应或经输血传播疾病的风险。但目前血小板的临床输注仍存在一些难点，主要表现在以下方面：（1）血小板制品（22±2） ℃震荡保存，带来了相对较高的细菌污染风险。美国的一项研究显示每1 000份血小板制品中有0.51份被污染^[1]。有些国家，如墨西哥已经对临床使用的血小板进行细菌污染强制检测^[2]。鉴于常温保存的缺点，血小板的冷冻保存成为近几年的研究热点。研究表明过期冻存血小板（>5 d）解冻后功能与采后1 d冻存血小板相似，提示过期血小板可能是一个合适的冷冻保存起始材料^[3]。Waters等^[4]研究表明钙在冻存诱导的血小板保存损伤中起重要作用，在冷冻前补充钙螯合剂可提高血小板回收率，显著降低冻存血小板表面活化标记物的增加。（2）同种免疫产生的血小板特异性抗体及人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）抗体所导致的血小板输注无效等输血不良反应在临床上颇为常见^[5,6]。日本的一项研究显示使用血小板产品治疗的患者中有7.1%出现过敏性输血反应^[7]。对患者进行血小板配型试验可以提高输注效率，但同时需要进行供者HLA分型、患者血清抗体分析和交叉配型，很大程度上提高了血小板输注的成本。（3）血小板献血员捐献行为不可预料，可能由于天气、假期等因素导致供应短缺或血小板产品的浪费。一项研究对2012、2017年我国36家采供血机构采供血情况进行了调研，发现2017年较2012年单采血小板临床需求量和每万人口用单采血小板量的增长率分别为69.6%、64.4%^[8]。随着我国社会人口逐渐老龄化，可能导致血小板临床需求持续增长以及合适捐献者数量逐渐减少，供需矛盾势必加剧。因此，体外规模化制造血小板产品成为一项值得研究开发的生物医学工程。多能干细胞（pluripotent stem cells，PSC）是体外产生血小板前体细胞巨核细胞（megakaryocyte，MK）和功能性血小板的主要来源之一，包括人胚胎干细胞（human embryonic stem cell，hESC）和人诱导多能干细胞（human induced pluripotent stem cells，hiPSCs）。其中hiPSC具有较高的可用性、较广泛的来源及相对较少的伦理争议，被认为是体外生产血小板的最佳选择^[9,10]。本文主要介绍了hiPSC来源血小板制品的研究进展。

由非胚胎细胞和组织直接在体外重新编程诱导的hiPSCs，与hESC一样具有无限增殖和多向分化功能。近年来hiPSCs的研究备受生物医学界的关注。2006年，Takahashi等^[11]首次利用逆转录病毒向成纤维细胞中引入4个转录因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc对其进行重编程转化为hiPSCs。此后，不同的诱导方法相继被报道，各种结合不同转录因子和化学因子的诱导后培养方案也相继被提出。一项研究比较了2种不同的基于RNA的hiPSCs生成方法即合成修饰信使RNA或编码重编程因子和GFP的自复制RNA，利用这2种基于RNA的方法，均获得了没有基因组改变的无整合hiPSCs，研究者认为基于自复制RNA的方法对于临床应用不同类型体细胞的重编程可能更为合适有效^[12]。hiPSCs可来源于多种体细胞。目前外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMCs）和尿液细胞被认为是相对理想的细胞来源^[13]，但对于产生hiPSCs的首选细胞种类尚无定论。探索方便获得、易于培养、能高效重编程、不易突变的细胞来源，将会为未来hiPSCs的临床应用提供更大的支持。

hiPSCs是疾病建模、药物筛选及细胞治疗等领域的一种理想的细胞来源。随着基因编辑技术如CRISPR/Cas9的发展，hiPSCs用于神经系统、心血管系统、泌尿系统和血液系统疾病治疗及药物筛选等领域的相关报道越来越常见^{[14,15,16,17,18,19,20]}。hiPSCs在体外可被诱导为血液细胞，从RhD阴性体细胞源中获得的hiPSCs细胞系具有典型的多能干细胞特征，可作为产生通用红细胞的细胞来源^[21]。Demirci等^[22]指出从hiPSCs中产生造血干细胞是一个活跃且有前景的研究领域，体外来源于hiPSCs的造血干细胞为研究发育性造血及各类血液病治疗提供了巨大的治疗潜力。Borst等^[23]综述了体外来源MK和血小板的潜在临床应用价值，介绍了从hiPSCs产生和扩增MK的实验方法，以及这些细胞在疾病建模中的应用。尽管hiPSCs技术尚处于起步阶段，发展面临着巨大的困难和挑战，但相信不久的将来hiPSCs的应用将会在个体化再生医学和肿瘤免疫治疗等方面展现出广阔的前景。

hiPSCs具有来源广、可直接从外周血分离、体外可诱导分化为MK等优点，是临床输注血小板的潜在来源和研究人类血小板的有利工具。如何利用体外培养系统产生造血生态，从同一来源同时建立的众多克隆中选择所需的hiPSCs克隆一直是研究热点。研究表明原癌基因c-Myc的编辑及其激活模式影响hiPSCs来源血小板的生成。在分化过程中，选定的hiPSCs克隆中c-Myc的初始表达及再激活后表达的减少与体外更有效地产生血小板特定抗原CD41a⁺ CD42b⁺血小板相关。相反，MKs中持续和过度的c-Myc表达则会抑制血小板释放，同时MKs生成过程也会延长。这表明，c-Myc的表达模式，特别是激活后适时的下降，是从选定的hiPSCs克隆中产生功能性血小板的关键^[24]。Ono等^[25]为了筛选MK诱导因子，对本身不分化成MKs的小鼠胚胎成纤维3T3细胞进行重编，发现p45 NF-E2/Maf-G/Maf-K转染的3T3细胞中CD41⁺细胞的百分率最高。将转染这些基因的成人真皮成纤维细胞在MK系诱导培养基中培养，发现培养细胞具有MK特征，包括表面标记和形态，且超过90%的MK表达CD41（早期MK标志物）。将这些MK输入到免疫缺陷的小鼠体内，可以观察到时间相关性的人类CD41⁺血小板大小的颗粒。研究表明p45 NF-E2、Maf-G和Maf-K的结合是MK和血小板生成的关键决定因素。Kuvardina等^[26]发现runt相关转录因子1（runt-related transcription factor 1，Runx1）通过抑制红细胞主调节因子Krüppel样因子1（Krüppel-like factor 1，Klf1）的表观遗传，在MK分化过程中抑制红细胞基因表达程序，Runx1与Klf1位点的结合在MK分化过程中显著增加。Cullmann等^[27]研究表明GATA1和Pbx1的过度表达可使MK的输出量增加2~2.5倍，并使MK的收集时间延长，但并不能促进MK的成熟或血小板的释放。关于体外诱导MKs的研究发现GATA2和Runx1与TF核心（Gata1、Tal-1、Lmo2和c-Myc）在体外可直接将人和小鼠成纤维细胞转化为类似于真正MK祖细胞的CD41⁺细胞，当移植到免疫功能低下的小鼠体内时，这些MK样祖细胞能够植入并分化成能产生CD41⁺ CD42⁺的功能性MKs。该研究描述的直接转化过程仅需12 d，且产生的MK样祖细胞具有30倍的扩增能力，能够在体内分化并产生血小板^[28]。美国最新一项研究尝试建立hiPSCs衍生MKs中表达基因和蛋白质的综合数据库，结果显示一些基因和蛋白质在hiPSCs衍生MKs中高度表达，但在MK或血小板功能中的作用尚不清楚，研究者认为这些基因和蛋白质是未来研究造血、血小板形成和血小板功能的理想候选基因^[29]。综上，hiPSCs的基因编辑、转化为MK及血小板的过程中关键点控制是目前研究的热点和难点，探究这些问题将从根本上促进hiPSCs来源血小板制品的发展。

Moreau等^[30]报道了一种MK正向编程方法，使每个hiPSCs细胞可产生2×10⁵个MKs，且获得的MK质量分数可达90%以上。在整个培养过程中100万个hiPSCs可产生几个输血单位的功能性血小板，倘若结合高效冷冻和GMP兼容的培养体系，这种方法非常适合体外生产血小板用于输血治疗。美国的一项研究在最佳范围内以新的物理参数放大生物反应器，在8 L反应罐中利用hiPSCs产生了超过1 000亿个血小板。血小板的体内外评价显示其功能与供体血小板相当。该项研究还计划建立HLA-I类敲除的通用血小板，以供临床应用和进一步工业化生产^[9]。Karagiannis等^[31]阐述了在体外hiPSCs向巨核细胞分化产生临床相关数量血小板的方法，包括利用生物反应器重现体内生化和物理性质的细胞微环境，指出在未来10年，干细胞来源的血小板有望应用于临床。2018年的一项研究，通过引入3种转基因c-Myc、BMI1和Bcl-xL以及提供湍流能量和剪切应力的生物反应器，从基于hiPSCs的永生化MK细胞系中生产了2 000亿个血小板^[32]。以上研究提示探索无限接近体内细胞微环境的生物反应器是未来利用hiPSCs体外量产血小板需要解决的主要问题。

HLA-Ⅰ类抗原同种免疫引起的血小板输注无效是一个棘手的临床问题。尽管一些研究尝试用酸处理等方法使血小板表面HLA-I类复合物的表达降低了71%^[33]，但目前供采血和临床输血机构尚无法将其作为常规操作。HLA基因沉默的血小板可逃避HLA抗体介导的细胞毒性，从而避免HLA-Ⅰ类抗体引起的血小板输注无效。通过抑制HLA-Ⅰ类基因的表达，制备出稳定的HLA通用型hiPSCs，用来生产低免疫原性的血小板产品^[34]。Norbnop等^[35]利用成对的CRISPR/Cas9 nickas基因敲除β2微球蛋白基因，成功地在体外产生了无HLA-Ⅰ类抗原表达的功能性hiPSCs来源血小板。Suzuki等^[36]通过基因操纵开发了人类hiPSCs来源的HLA-I缺陷型血小板，并评估了它们的免疫原性，揭示了此类血小板独特的非免疫原性，为HLA-I缺陷型血小板的临床应用提供了概念依据。Nakamura等^[37]研究提示完全无病原体的供体提供的hiPSCs来源血小板有望通过独立生产来补充血液来源，且可以通过产生自体/HLA同源或HLA缺陷产物来克服同种异体免疫血小板输注的局限性。Sugimoto等^[38]用c-Myc、BMI1和Bcl-xL基因转染hiPSCs来源的造血祖细胞，建立了一个自我更新的永生化MK系，同时利用基因改造技术进一步产生了HLA-Ⅰ类抗原表达缺失的血小板。可以看出，通过基因工程技术，利用hiPSCs制备无HLA抗原表达的血小板前体在实验研究阶段已取得一定成果。虽然目前尚无此类产品临床应用的相关报道，但其为解决血小板输注不良反应提供了新思路。

体外制备的hiPSCs来源血小板制品在质和量上要达到临床输注水平，尚面临一定的挑战。首先是临床应用的安全性。由体细胞重编程为hiPSCs及后续的传代培养过程中，多种因素可能使细胞发生致瘤性。hiPSCs来源血小板制品中残留的hiPSCs，输入人体后有一定的风险。辐照等方法在一定程度上可解决此问题，但具体有效程度及其对血小板功能的影响尚不明确^[39]。因此，应从源头上关注如何降低hiPSCs的致瘤性及如何更有效去除产品中残留的有核细胞。其次，体外培养过程中有效抑制血小板活化也是一项挑战。37 ℃培养血小板时，生成的血小板受各因素影响不断被激活，活化后的血小板会降低其输注效果。研究显示金属蛋白酶17抑制剂KP-457能有效地抑制血小板表面膜糖蛋白GPIb脱落，减少活化，因此可以利用其在37 ℃由hiPSCs生产功能性血小板^[40]。另外，生产的血小板及其前体细胞如何更有效保存，也是面临的挑战。有效的低温保存技术可以提供长期储存和积累必要数量MKs的机会。Pogozhykh等^[41]描述了冷冻保存hiPSCs来源MKs的可能性，并提出了综合评价冷冻保存后MKs表型和功能特征的方法。Patel等^[42]研究了一种保持MKs产品表型和功能的冷冻保存方法，将解冻后的产品输注到免疫缺陷小鼠中，在输注后一定时间内可以观察到功能性人类血小板，且呈数量级增长，证明了这种低温保存后的MKs产品在体内可释放功能性血小板。针对这些挑战，未来hiPSCs来源血小板的研究及应用中，应关注终产品中残留有核细胞的数量及致瘤性，不断优化细胞培养及保存体系，以提高功能性血小板的产率，确保终产品满足临床输注标准。

从hiPSCs出发，通过引入特定的基因组，建立具有强大增殖能力的MK系，可扩增的MKs可冷冻保存，因此适合作为药品生产质量管理规范级血小板生产的原料细胞，并能够实现按需生产、降低细菌污染概率、避免经输血传播疾病。从储存的同源HLA型hiPSCs文库中制备自体产物和HLA相容性血小板或通过操纵HLA和/或HPA可进一步解决输血相关的同种免疫不良反应。目前，hiPSCs来源的血小板体外生产的细节和成本仍然是主要障碍。一旦这些障碍被克服，体外生产hiPSCs来源血小板的输注有望实现，以满足患者及时接受安全有效血小板输注的需求。