近年来，根管治疗后出现的牙髓活力丧失、牙齿脆性增加和牙体易折裂等问题逐渐引起重视，牙髓再生成为牙髓病和根尖周病治疗领域的研究热点。牙髓再生中的血管再生是重中之重。研究发现多肽水凝胶支架材料既能影响细胞行为，促进血管生成，还可以根据需要进行改性，应用灵活，受到了广泛关注。主要对离子互补性多肽、表面活性剂类多肽和化学基团修饰类多肽在牙髓再血管化中的应用进展进行综述，总结多肽水凝胶支架材料的特点，为其在牙髓再生中的进一步应用提供一定借鉴。
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根管治疗是目前临床上治疗牙髓病和根尖周病最常用的一种方法，能够一定程度延长牙齿在口腔内的存留时间。然而，根管治疗后牙髓活力丧失，牙齿脆性增加，容易发生折裂，导致牙齿丧失。因此，寻求一种既能恢复牙髓形态，又能重建牙髓功能的治疗方法至关重要。随着组织工程学和再生医学的发展，以干细胞、支架材料和生长因子三要素为基础的牙髓再生逐渐成为牙髓病和根尖周病治疗领域的研究热点。牙髓中丰富的毛细血管网具有为牙髓组织提供营养和清除代谢废物等功能。然而，由于牙髓组织周围均由牙体硬组织包绕，仅通过细小的根尖孔与根尖周组织联系，当牙髓组织发生损伤时，根管系统复杂的解剖结构和狭窄的根尖通道限制了新生血管的形成[1]，导致牙髓组织很难自行修复。通过组织工程技术促进血管生成对于牙髓组织再生和长期存活非常关键。
支架材料在牙髓再生尤其是牙髓血管生成中发挥重要作用。近年来，多肽水凝胶因其合成简单、生物相容性好、低毒性、低免疫原性以及可注射性等众多优势被广泛用于牙髓再生相关研究。根据交联方式不同，多肽水凝胶分为通过共价键交联形成的化学凝胶和通过非共价键作用交联形成的物理凝胶。多肽物理凝胶主要通过分子自组装的方法实现，在牙髓再血管化中应用广泛。自组装多肽包括离子互补性多肽、表面活性剂类多肽和化学基团修饰类多肽[2]。本文主要对多肽水凝胶支架材料在牙髓再血管化中的应用进展进行综述，分析其优缺点并提出未来展望。
离子互补性多肽的特征是亲水性和疏水性的氨基酸残基交替排列，带电荷的氨基酸残基以正负交替的方式排列，通过静电相互作用、氢键和范德华力进行自组装。RADA16-I作为经典的离子互补性多肽在生物医学领域得到了广泛应用。而多结构域多肽（multidomain peptide，MDP）则通过在离子互补性多肽的中间或末端添加短的生物活性信号肽合成获得，应用前景广阔[3]。
RADA16-I[Ac-(RADA)4-NH2，RAD]是由精氨酸、丙氨酸和天冬氨酸的重复序列组成的自组装短肽，具有良好的生物相容性、可注射性和低细胞毒性，在一价阳离子溶液或生理条件下有自发形成β折叠结构的倾向[4]，在pH 7.0时可以实现自组装，形成类似细胞外基质的三维纳米纤维结构，支持细胞黏附和增殖，在三维细胞培养、药物递送及组织再生领域有巨大的应用潜力。PuramatrixTM是商品化的RADA16-I可注射自组装多肽水凝胶，支持牙髓干细胞（dental pulp stem cells，DPSCs）在体外的存活及牙源性分化，已被用于牙源性干细胞再生血管化牙髓潜力以及血管生成触发机制研究[5]。研究表明，在不添加外源性生长因子的条件下，PuramatrixTM负载牙源性干细胞后注入根管，可见成牙本质细胞样细胞及血管化组织形成[6,7]。Dissanayaka等[8]研究发现PuramatrixTM可以在不添加外源性生长因子情况下为细胞存活、迁移以及毛细血管网络形成提供多肽纳米纤维微环境，DPSCs通过分泌血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、促进人脐静脉内皮细胞（human umbilical vascular endothelial cells，HUVECs）的存活及迁移来促进血管生成，大鼠实验观察到血管化牙髓样组织及骨样牙本质生成。
为进一步提高血管生成能力，学者们研究了在PuramatrixTM水凝胶中添加外源性生长因子或功能化修饰序列的可行性。Mu等[9]将RADA16-I与干细胞因子结合后，负载人牙髓干细胞（human dental pulp stem cells，hDPSCs）和HUVECs，不同时间点进行细胞活性、增殖以及体外血管生成实验。结果表明，加入干细胞因子的RADA16-I水凝胶支架在体外可促进hDPSCs的黏附、增殖和迁移，刺激HUVECs分泌血管内皮生长因子A，形成的血管样结构显著增多。Xia等[10]在PuramatrixTM多肽水凝胶基础上合成了具有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（arginine-glycine-aspatic acid，RGD）模拟肽PRG（序列PRGD SGYRGDS）和VEGF模拟肽KLT（序列KLTWQEL YQLKYKGI）表位的功能化支架RAD/PRG/KLT。该支架材料组装而成的纳米纤维更厚，加入细胞培养液后，自组装成透明的水凝胶，扫描电镜下可以看到互相交织的多孔纳米纤维结构，为细胞培养提供了有利的三维微环境。且该材料包含多个功能序列，使DPSCs在体外的存活、黏附、增殖、牙源性分化以及成血管分化能力显著提高。
此外，有研究通过对牙源性干细胞进行基因修饰，提高其血管生成性能。Zhu等[11]使用慢病毒转染技术，分别转染VEGF和基质细胞衍生因子1α基因于hDPSCs。将PuramatrixTM水凝胶包裹的改良DPSCs复合体注入6 mm长的人牙根段，再植入免疫缺陷小鼠体内培养4周，结果显示过表达VEGF和过表达基质细胞衍生因子1α的DPSCs联合使用可以显著增加根管内新生牙髓样组织的长度及新生血管密度。
上述研究提示，RADA16-I多肽水凝胶是一种适用于牙髓再生/再血管化的支架，在缺乏外源性生长因子的条件下仍可支持牙源性干细胞和血管内皮细胞的存活、迁移、牙髓样组织生成及血管形成。在RADA16-I多肽水凝胶中添加生物活性分子或功能性短肽也不影响其自组装性能，而且能够进一步提高血管生成能力。对牙源性干细胞进行基因修饰也是一个可行的方法，但使用慢病毒转染的安全性有待验证。此外，RADA16-I多肽水凝胶也存在一定的局限性，其从溶液到凝胶的转变过程较复杂，需要将溶液的pH值通过溶剂置换从酸性逐渐变为中性，而且当水凝胶在中性环境下进行搅拌时，会由于静电相互作用产生沉淀[12]。上述问题都有待深入研究解决。
Zhao等[12]使用谷氨酸和苏氨酸替换RADA16-I多肽中的天冬氨酸得到RATEA16。RATEA16在中性pH条件下，无需引入任何外部引发剂，即可自发形成稳定透明的水凝胶。张瑞娟等[13]研究发现RATEA16在体外具有良好的生物相容性、生物降解性和可注射性。RATEA16多肽水凝胶支架可以为HUVECs提供增殖和迁移的微环境，负载VEGF的RATEA支架体系通过持续释放VEGF，促进HUVECs在体外的增殖、迁移和成血管分化[14]，提示负载VEGF的RATEA16可能在牙髓再生组织工程及牙髓血运重建中发挥巨大作用。然而，所需负载的VEGF成本较高，释放速度难以精确控制，因此仍需进一步研究在RATEA16多肽上连接功能性多肽序列如VEGF模拟肽的可行性。
MDP是一类具有不同结构域的自组装多肽，各个结构域可以根据应用需求进行单独设计，且其改变相互独立，因此在生物医学工程领域的应用非常广泛。MDP水凝胶支架材料能有效模拟天然细胞外基质的结构，有利于细胞的黏附和生长，还具有触变性和可调节的黏弹性，经注射器输送后可在原位重新组装[15]，在牙髓再生领域具有广阔的应用前景。
Galler等[16]设计了具有细胞黏附序列RGD和基质金属蛋白酶-2（matrix metal proteinase-2，MMP-2）酶切位点的生物可降解MDP即K(SL)3RG(SL)3 KGRGDS。将该MDP多肽水凝胶与DPSCs以及生长因子复合后，注入牙本质圆柱体，随后植入免疫缺陷小鼠皮下，观察到水凝胶在6周内降解，伴有血管化的牙髓样疏松结缔组织形成[17]。在另一项研究中，Galler等[18]发现牙本质预处理对DPSCs在牙本质界面的分化、细胞与牙本质界面的相互作用以及牙髓-牙本质复合体再生效果都会产生影响。Kumar等[19]研究了一系列用于促进血管生成的自组装MDP，其中由基础序列SLSLSLSLSLSL、血管生成序列KLTWQELYQLKYKGI和MMP-2酶切位点LRG组成的多肽SLanc表现出优越的血管生成能力。实验结果显示，将SLanc多肽水凝胶植入大鼠皮下，植入后3 d即可观察到细胞长入，且大部分细胞为CD68+巨噬细胞。整个过程没有出现炎症反应或纤维包裹。植入后7 d肉眼可见围绕着植入物形成了大量成熟的血管网。快速的血管生成和成熟提示该血管生成肽在组织再生治疗中有一定的优势。Siddiqui等[20]通过去除SLanc多肽中的酶切位点LRG，得到多肽SLan，解决了SLanc降解速度快的问题，优化了血管生成肽序列的设计。SLan具有良好的可注射性、原位快速成胶特性、血管生成能力以及延长的体内作用时间。他们在犬牙髓切除模型中注射SLan多肽水凝胶，发现SLan能够模拟细胞外基质的结构，刺激牙髓血运重建。再生的牙髓组织再现了牙髓的主要特征，包括血管、神经纤维和靠近牙本质的成牙本质细胞层，提示SLan可以用作体内牙髓组织再生支架。Kobayashi等[21]将诱导多能干细胞来源的颅神经嵴样细胞、SLan和生长因子混合物注入第三磨牙根段后，植入小鼠背部，发现颅神经嵴样细胞在该环境作用下可分化为牙髓细胞样细胞和成牙本质细胞样细胞，SLan可诱导密集的新生血管形成，进一步证明了SLan在牙髓再生中应用的显著优势。
MDP的氨基酸序列可以进行广泛修改和修饰，在不影响其自组装的条件下实现功能化，进而满足各种应用需求。加入的生物活性氨基酸序列呈现出较高的表位密度，有利于改变细胞行为，包括细胞黏附和血管形成[22]。同时，与直接加入外源性生长因子相比，对MDP进行修饰的成本更低[23]。作为一种触变性材料，基于超分子相互作用的自组装过程使MDP纳米纤维容易断裂和重组，因此具有良好的剪切稀化和恢复能力[24,25]，但这同时也导致其机械强度降低，无法满足牙髓再生相关要求。此外，如何精确控制多肽水凝胶的降解速度还有待研究[26]。
表面活性剂类多肽分为亲水区和疏水区，亲水区一般由1~2个带电的氨基酸残基组成，疏水区一般由3~9个非极性氨基酸组成。NapFF是一种自组装肽两亲化合物，由萘乙酰基与苯丙氨酸二肽的N端偶联组成，具有很强的自组装能力，可形成水凝胶。Laverty等[27]在NapFF的基础上加入赖氨酸，合成NapFFKK及其变异体NapFFεKεK-OH，其中ε氨基形成肽键的一部分，而不是标准的氨基基团。Afami等[28]研究发现NapFFεKεK-OH具有良好的生物相容性和一定的抗菌活性，且包裹在NapFFεKεK-OH水凝胶中的DPSCs可以产生具有成血管功能的分泌组。此外，作为一种超短肽，NapFFεKεK-OH结构简单，合成容易，成本较低。这些结果表明，NapFFεKεK-OH水凝胶可能作为一种新型的水凝胶用于牙髓再生组织工程。
除上述已经用于牙髓再血管化研究的多肽外，有些在非口腔医学领域的再血管化中广泛研究的多肽也可为未来的牙髓再血管化研究提供一定借鉴。
多肽水凝胶组成明确，易于设计，制备简单，具有良好的生物相容性、生物可降解性和可调节的黏弹性，还可加入生物活性因子或功能化基序进行修饰以增强生物性能。此外，多肽水凝胶能够通过促进血管内皮细胞的增殖、黏附以及支持毛细血管网生成，在牙髓再血管化中具有显著的优势。但多肽水凝胶的机械强度较低，需要进一步提高体内稳定性；含有特殊氨基酸或特殊结构的多肽合成难度较高，不适合批量生产；多肽水凝胶的降解及其负载的生物活性分子的释放难以精确控制。此外，与天然蛋白质相比，多肽的功能仍较为单一，不同多肽共组装以获得多样的功能是一个新的思路。相信随着材料学的发展和组织工程技术的推进，多肽水凝胶支架材料将在牙髓再血管化中发挥更加重要的作用。
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