探讨Sirtuin 1（SIRT1）调控内质网应激在蛛网膜下腔出血（SAH）后早期脑损伤中的作用。
采用颈内动脉穿刺的方法构建小鼠SAH模型。Western Blot和实时荧光定量PCR检测SAH后0、3、6、12、24、48、72 h SIRT1的蛋白和mRNA的表达水平，给予SIRT1抑制剂sirtinol或SIRT1小干扰RNA（siRNA）后Western Blot检测SIRT1和内质网应激相关标志物葡萄糖调节蛋白78（GRP78）、磷酸化蛋白激酶R样内质网激酶（p-PERK）/PERK、磷酸化真核细胞翻译起始因子2α（p-eIF2α）/eIF2α和C/EBP同源蛋白（CHOP）的表达水平及SAH后24 h检测SAH评分、神经功能评分、脑含水量和血脑屏障完整性。
与其他时间点相比，在24 h时，SIRT1蛋白和mRNA的表达最高，其差异有统计学意义（均P<0.001）。抑制SIRT1表达后内质网应激相关的蛋白GRP78、p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α和CHOP表达量增加，加剧出血量和脑含水量、破坏血脑屏障完整性，显著降低神经功能评分。
抑制SIRT1表达显著增加内质网应激发反应，加剧SAH后的早期脑损伤。
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蛛网膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）是一种高发病率和高死亡率的神经系统疾病，主要由动脉瘤破裂引起，严重威胁人类健康[1]。约11% SAH患者在到达急诊室之前死亡，30%~50%幸存者会出现认知功能障碍[2]。SAH后前72 h被称为早期脑损伤，是治疗患者的关键时间窗，约50%的患者死于这一时期[3]。因此，治疗早期脑损伤是治疗SAH并改善预后的关键。研究发现内质网应激介导的神经凋亡在SAH后早期脑损伤病理过程中发挥重要作用[4,5]。内质网是一种具有管状膜网络的细胞器，负责钙的储存和信号传递，以及蛋白质的折叠和加工[6]。内质网表现出多种应激反应，包括未折叠蛋白反应、内质网超载反应和内质网相关的损伤。在SAH中，内质网应激通过未折叠蛋白反应对调节神经细胞存活发挥至关重要的作用[7]。
Sirtuin 1（SIRT1）是Sirtuin家族的成员，是一种组蛋白去乙酰化酶，在人类表观遗传修饰中发挥重要作用[8,9]。研究发现，SIRT1在调节SAH后早期脑损伤中发挥着重要的作用[10,11,12]。此外，研究发现在结肠炎等疾病中，SIRT1介导的内质网应激发挥重要的调控作用[13,14]。然而，SIRT1调控内质网应激在SAH中的作用尚未见报道。因此，本研究将讨论激活SIRT1是否在SAH诱导的内质网应激中发挥重要的功能，是否能为SAH后早期脑损伤的治疗提供新的治疗策略。
雄性C57BL/6小鼠（20~25 g），动物生产许可证号SCXK（辽）2020-0001，购于北部战区总医院实验动物科。根据动物实验报告规范ARRIVE指南，小鼠饲养在温度（22±2）℃和湿度60%的条件下，并保存12 h昼夜循环，可自由进食和饮水。所有实验方案均经过北部战区总医院伦理委员会批准（批准号2022038）。BCA蛋白定量试剂盒、RNA分离试剂盒（碧云天生物技术有限公司），SIRT1、蛋白激酶R样内质网激酶（phosphorylated protein kinase R-like ER kinase，PERK）和磷酸化真核细胞翻译起始因子2α（phosphorylated eukaryotic initiation factor 2α，p-eIF2α）一抗（美国Cell Signaling Technology公司），葡萄糖调节蛋白78（glucose-regulated protein，GRP78）、eIF2α、活性转录因子4（active transcription factor 4，ATF4）和C/EBP同源蛋白（C/EBP homologous protein，CHOP）一抗（美国Santa Cruz Biotechnology公司），p-PERK（北京博奥森生物技术有限公司），SYBR Green Supermix（美国Bio-Rad公司），SIRT1抑制剂sirtinol（美国Sigma公司）。
采用颈内动脉穿刺的方法构建小鼠SAH模型。1%戊巴比妥钠（40 mg/kg）腹腔注射麻醉小鼠后，解剖右颈动脉、颈外动脉（external carotid artery，ECA）和颈内动脉（internal carotid artery，ICA）。采用4-0的单丝尼龙缝线从ECA残端沿吻部进入ICA。穿刺15 s后，将缝线拔入ECA残端，再灌注ICA，从而形成SAH。假手术组小鼠未行血管穿刺，其余操作同上。
将54只小鼠随机分为3组，每组18只，分别为假手术组、模型组及抑制剂组。sirtinol使用前用含1%二甲基亚砜的生理盐水制备成2 mmol/L的工作液。在SAH造模前2 h侧脑室注射3 μl sirtinol工作液或等体积溶剂。利用抑制剂sirtinol考察SIRT1对内质网应激和SAH后早期脑损伤的影响。
将72只小鼠随机分为4组，每组18只，分别为假手术+小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）对照组、模型+siRNA对照组、假手术+SIRT1 siRNA组及模型+SIRT1 siRNA组。在小鼠颅骨上钻1个1.0 mm的孔，不刺破硬脑膜。然后，将10 µl Hamilton注射器的针头立体垂直地插入孔中，位于前囟的水平面下方3.0 mm处，进入左侧脑室。总共2 µl的SIRT1 siRNA（500 pmol）在SAH诱导前48 h以相同的速率注入，在输液后10 min缓慢取出注射器。对照组以同样的方法和剂量注入siRNA。利用siRNA干扰技术考察SIRT1对内质网应激和SAH后早期脑损伤的影响。
每组6只，SAH造模24 h后取小鼠脑组织，根据Sugawa评分标准[15]，将基底池分为6个节段，根据SAH量将每个节段划分为0~3级。0级：无SAH；1级：蛛网膜下腔微量出血；2级：中度凝块；3级：血块和可识别的动脉。将6个节段的分数相加（总分0~18分），出血量越大分级越高。
每组6只，SAH造模24 h后，采用Sugawa评分标准[15]进行神经功能评分，评估由六项测试组成，分数为0~3分或1~3分。六项测试包括：自发活动、四肢运动的对称性、前爪伸展、攀登、身体本体感觉和对胡须刺激的反应，最高分为18分，最低分为3分，分数越高，功能越强。
每组6只，造模24 h后处死取小鼠大脑，分为左右大脑半球和小脑，称湿质量。然后将脑标本在110 ℃的烤箱中烘干72 h，并再次称质量（干质量），计算脑含水量。
脑含水量（%）＝（湿质量－干质量）/湿质量×100%
每组6只，将伊文思蓝染料（2%，5 ml/kg）注入左股静脉循环1 h，麻醉后用生理盐水心内灌注处死小鼠并取脑，分为左右大脑半球和小脑，称重后浸泡在甲酰胺中（10 ml/g），60 ℃孵育，用酶标仪测量渗出物在620 nm处的吸光度（A）值。用伊文思蓝渗出量评估SAH后24 h的血脑屏障通透性。
每组6只，取小鼠右侧大脑组织在RIPA裂解液中匀浆，4 ℃下12 000 r/min离心10 min。使用BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度。10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳（每组40 μg蛋白），并转移至PVDF膜上，然后在室温下采用5% BSA封闭1 h。将PVDF膜在4 ℃分别与SIRT1（1∶500）、GRP78（1∶200）、p-PERK（1∶1 000）、PERK（1∶800）、p-eIF2α（1∶500）、eIF2α（1∶200）、ATF4（1∶200）和CHOP（1∶200）一抗抗体孵育过夜。TBST洗涤后，与二抗在室温下孵育1 h，用ECL发光液显影，采用Image J软件分析免疫印迹条带的相对密度。
采用实时荧光定量PCR技术分析SIRT1 mRNA水平。使用RNA分离试剂盒按照说明书提取总RNA。使用第一链cDNA合成试剂盒将分离的RNA逆转录为cDNA。使用SYBR Green Supermix进行实时PCR。SIRT1正向引物序列：5’-GGCACCGATCCT CGAACAAT-3’，反向引物序列：5’-CGCTTTGGTG GTTCTGAAAGG-3’；β-actin正向引物序列：5’-AG GGAAATCGTGCGTGAC-3’，反向引物序列：5’-CGCT CATGCCGATAGTG-3’。扩增条件为1个95 ℃循环2 min，然后39个95 ℃循环15 s，60 ℃循环15 s。根据2−ΔΔCt计算mRNA表达的变化，其中ΔCt＝Ct靶基因－Ctβ-actin，ΔΔCt＝ΔCtSAH－ΔCtsham。
采用SPSS 17.0软件对数据进行统计学分析，符合正态分布的连续性变量以均数±标准差（
±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析（One way-ANOVA），以P<0.05为差异有统计学意义。
如图1所示，与0 h比较，12、24、48、72 h时SIRT1蛋白的表达升高，其差异有统计学意义（均P<0.05）；与0 h比较，6、12、24、48、72 h时SIRT1 mRNA的表达升高，其差异有统计学意义（均P<0.05）。与其他时间点相比，在24 h时，SIRT1蛋白和mRNA的表达最高，其差异有统计学意义（均P<0.001）。因此，选择SAH后24 h用于之后的实验。
SAH—蛛网膜下腔出血；SIRT1—sirtuin 1。与0 h相比，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001
如图2所示，与假手术组相比，模型组SIRT1蛋白表达增加（P<0.001），内质网应激相关蛋白GRP78、p-PERK、p-eIF2α、ATF4和CHOP表达均增加（均P<0.001）。与模型组相比，sirtnol组SIRT1蛋白表达减少（P<0.001），内质网应激相关蛋白GRP78、p-PERK、p-eIF2α、ATF4和CHOP蛋白表达增加（均P<0.001）。
SAH—蛛网膜下腔出血；SIRT1—sirtuin 1；GRP78—葡萄糖调节蛋白78；p-PERK—磷酸化蛋白激酶R样内质网激酶；p-eIF2α—磷酸化真核细胞翻译起始因子2α；ATF4—活性转录因子4；CHOP—C/EBP同源蛋白；1—假手术组；2—模型组；3—sirtnol组。与假手术组相比，###P<0.001；与模型组相比，***P<0.001
如图3所示，与假手术+siRNA对照组相比，模型+siRNA对照组SIRT1蛋白表达增加（P<0.001），内质网应激相关蛋白GRP78、p-eIF2α和ATF4表达均增加（均P<0.001）。与假手术+SIRT1 siRNA组相比，模型+SIRT1 siRNA组SIRT1蛋白表达增加（P<0.001），内质网应激相关蛋白GRP78、p-eIF2α和ATF4表达均增加（均P<0.001）。上述结果提示减少SIRT1蛋白表达加剧了内应网应激反应。
SAH—蛛网膜下腔出血；SIRT1—sirtuin 1；GRP78—葡萄糖调节蛋白78；p-PERK—磷酸化蛋白激酶R样内质网激酶；p-eIF2α—磷酸化真核细胞翻译起始因子2α；ATF4—活性转录因子4；CHOP—C/EBP同源蛋白；1—假手术+siRNA对照组；2—模型+siRNA对照组；3—假手术+SIRT1 siRNA组；4—模型+SIRT1 siRNA组。与假手术+siRNA对照组相比，###P<0.001；与假手术+SIRT1 siRNA组相比，***P<0.001
如图4所示，与假手术组相比，模型组SAH评分增加，神经功能评分降低，脑水肿和伊文思蓝渗出量增加，其差异比较均有统计学意义（均P<0.001）。与SAH组相比，给予SIRT1抑制剂sirtinol后，SAH评分增加，神经功能评分降低，脑水肿和伊文思蓝渗出量增加（均P<0.05）。
SAH—蛛网膜下腔出血；SIRT1—sirtuin 1；1—假手术组；2—模型组；3—sirtnol组。与假手术组相比，###P<0.001；与模型组相比，*P<0.05，**P<0.01
如图5所示，与假手术+siRNA组相比，模型+siRNA组SAH评分增加，神经功能评分降低，脑水肿和伊文思蓝渗出量增加，其差异比较均有统计学意义（均P<0.001）。与假手术+SIRT1 siRNA组相比，模型+SIRT1 siRNA组SAH评分增加，神经功能评分降低，脑水肿和伊文思蓝渗出量增加，其差异比较均有统计学意义（均P<0.001）。与模型+siRNA对照组相比，模型+SIRT1 siRNA组SAH评分增加，神经功能评分降低，脑水肿和伊文思蓝渗出量增加，其差异比较均有统计学意义（均P<0.05）。上述结果提示，抑制SIRT1能够加剧SAH后的早期脑损伤。
SAH—蛛网膜下腔出血；SIRT1—sirtuin 1；1—假手术+siRNA对照组；2—模型+siRNA对照组；3—假手术+SIRT1 siRNA组；4—模型+SIRT1 siRNA组。与假手术+siRNA对照组相比，###P<0.001；与模型+siRNA对照组相比，*P<0.05，**P<0.01；与假手术+SIRT1 siRNA组相比，&&&P<0.001
SIRT1是一种组蛋白去乙酰化酶，在人类表观遗传修饰中发挥重要作用，并调节氧化应激、炎症、免疫反应和细胞凋亡等重要功能[8,9]。研究发现，SIRT1在调节SAH后早期脑损伤中发挥着重要的作用[10,11,12]。本课题组前期研究发现SAH后内源性SIRT1升高，抑制SIRT1诱发炎症、加剧出血，加重SAH后早期脑损伤[11]。此外，研究发现在结肠炎等疾病中，SIRT1介导的内质网应激发挥重要的调控作用[13,14]。然而，SIRT1是否在SAH诱导的内质网应激中发挥重要的功能，是否能为SAH后早期脑损伤的治疗提供新的治疗策略，以及其确切的功能值得进一步关注并阐明。
本研究发现SIRT1在72 h内呈现先升高后下降的蛋白表达趋势，并且在24 h时表达最高，其差异有统计学意义（均P<0.001）。mRNA水平表达变化情况与蛋白水平相一致，因此选择24 h作为研究时间点。研究表明，抑制SIRT1表达可促进eIF2α的乙酰化和磷酸化，其中SIRT1通过调节K141和K143位点eIF2α乙酰化以及丝氨酸Ser51/Ser52位点eIF2α磷酸化来调控未折叠蛋白反应[16]。SIRT1可抑制PERK的磷酸化，从而抑制内质网应激的PERK/ eIF2α/CHOP信号通路[17]。然而，SIRT1调控内质网应激在SAH中的作用尚未见报道。本研究采用siRNA干扰技术及蛋白特异性抑制剂考察了SIRT1对内质网应激的作用，结果显示SIRT1表达抑制后GRP78、p-PERK、p-eIF2α、ATF4和CHOP蛋白表达增加，内质网应激加剧。进一步考察了SIRT1蛋白在SAH后早期脑损伤保护作用中的功能，结果显示SIRT1特异性抑制剂sirtinol及SIRT1 siRNA干扰蛋白表达后均降低神经功能评分和破坏血脑屏障，加剧SAH后早期脑损伤。
综上所述，本研究基于内质网应激诱导的凋亡是SAH后早期脑损伤的的主要病理效应，选取与内质网应激病理机制密切相关的病理生理环节SIRT1为切入点，采用多种现代分子生物学研究手段，多层面探讨SIRT1介导的内质网应激在SAH后早期脑损伤中的重要功能，阐释SIRT1调控SAH后早期脑损伤的分子机制，为SAH的治疗提供新的治疗策略。
所有作者均声明不存在利益冲突
