牙周炎是导致牙周结缔组织破坏及牙槽骨吸收的慢性感染性疾病，其发病率广泛，严重危害了广大患者的口腔及全身健康。宿主免疫炎症反应在牙周炎组织破坏中起了主要作用。多形核中性粒细胞（PMNs）作为牙周组织中重要的免疫细胞成分之一，可通过释放促炎因子，引发宿主免疫炎症反应，进而导致牙周炎的发生。DNA甲基化可以通过调节基因表达而影响免疫细胞的功能发挥。生物信息学技术可以通过分析公共数据库中牙周炎患者与健康人群牙周组织基因表达谱及DNA甲基化数据，挖掘关键的PMNs DNA甲基化基因，阐释该基因对于牙周炎病理进展的影响，从而为牙周炎的治疗提供新思路。
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牙周炎是牙周病原菌和宿主免疫细胞防御反应相互作用而导致牙周结缔组织破坏及牙槽骨吸收的慢性感染性疾病[1]。牙周炎是最常见的口腔疾病之一，同时也是全球的第6大流行性疾病，发病率约为11%，约有7.43亿人受到影响[2]，患病初期可能由于临床症状不明显导致牙周炎由急性期转为慢性炎症，病情反复且久治不愈，严重地影响患者生活质量。牙周炎不仅影响牙齿功能，还可作为口腔癌、糖尿病、类风湿性关节炎、心血管疾病和阿尔茨海默病等多种疾病的危险因素，进而危害全身健康[3,4,5]。牙周炎发病机制复杂，随着相关机制研究的不断深入，目前的观点认为宿主在免疫炎症反应过程中，促炎因子可过度产生，因而在牙周炎组织破坏中起重要作用[6,7]，而不仅是细菌本身对牙周组织的破坏。这种认识模式的转变，使得宿主免疫调节成为一个新的研究热点。
作为牙周组织中重要的免疫细胞成分之一，多形核中性粒细胞（polymorphonuclear neutrophils，PMNs）近年来在牙周炎发病机制的相关研究中得到了充分关注。起初PMNs被认为是宿主抵御外界口腔细菌感染的第一道防线，在牙周组织中可发挥防御功能，维持牙周组织稳态；然而过度活跃的反应性PMNs可通过释放促炎因子，导致牙周组织破坏及牙槽骨吸收，加剧牙周炎发展[8]。因此，PMNs被视为一个潜在的牙周炎治疗靶标，积极探索PMNs在牙周炎发生发展中的机制，寻找关键的治疗靶点可能会给牙周炎的治疗提供新思路和新方法。本文对近年来多形核中性粒细胞PMNs与DNA甲基化的国内外研究进展进行综述，总结此研究的生物信息学方法及成果，并对其应用前景进行展望。
PMNs也常被简称为中性粒细胞，是牙周袋、牙龈缝隙和炎症牙周组织中最丰富的白细胞。在健康的牙周组织中，PMNs主要存在于连接上皮和裂隙液中，在口腔健康中起着至关重要的作用，因为它们在健康的牙周组织中维持细菌群落的共生，同时可在宿主牙周炎症状态中发挥杀菌作用[9]。研究证明，在牙周病致病菌感染初期，PMNs快速向已感染部位趋化迁移[10,11]，通过包括吞噬作用、活性氧释放、颗粒蛋白、细胞因子释放及细胞外捕获网[12]等多种机制清除病原体，能够有效吞噬杀灭病原菌微生物，对控制牙周感染和消除炎症反应有极其重要的作用[13]。然而尽管大量研究已证实，PMNs可以向牙周炎部位发生趋化募集，但关于PMNs对牙周组织究竟起保护还是破坏作用，目前仍存在争议[14]。
起初，PMNs因其寿命短并且在组织归巢后无法反向迁移到外周血中，因此并不被认为是一种异质细胞[15]。然而，研究表明PMNs在其局部微环境中可获得不同的表型，而不同表型的PMNs则在牙周炎发病过程中扮演着不同角色。在健康牙周组织中，PMNs不断被募集到口腔中，而不会引起临床上明显的炎症或组织破坏，这种中间免疫状态被称为"副炎症"，诱导机体从副炎症状态向促炎症状态的转变机制很可能是牙周炎发病机制的核心[16]。研究证实，口腔中存在2种PMNs亚群：副炎性亚群（para-inflammatory neutrophils，PAIN）和促炎性亚群（pro-inflammatory neutrophils，POIN），其中PAIN是健康口腔中的主要亚群，而后者则是晚发性牙周炎患者的主要亚群，与PAIN相比，POIN通常表现出较高的吞噬、脱颗粒、活性氧生成和细胞外捕网形成[16]等状态。Borenstein等[17]通过透射电子显微镜观察慢性牙周炎患者血液和唾液中的幼稚PMNs，口腔中的PMNs进入牙龈组织后表现出部分或完全激活的形态学变化，这与其副炎症或促炎症状态相对应。Gaudilliere等[18]对慢性牙周炎患者的全血样品进行检测，发现PMNs对牙龈卟啉单胞菌的主要致病因子-脂多糖，呈现促炎反应过度。当PMNs穿过牙龈组织时，它们的形态会向激活状态转变，并且促炎型PMNs颗粒减少，细胞质变浅，核常染色质增多，此过程被认为是牙周组织损伤的原因之一[19]。
这些证据表明，PMNs在牙周炎致病机制中扮演了双重角色，进一步探究PMNs功能变化的驱动因素可能为探寻牙周炎新机制及靶向PMNs治疗牙周炎带来新的思考。
DNA甲基化是一种表观遗传机制，是指基因组胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸（胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸，cytosine-phosphate-guanine，CpG）上的5位碳原子，在DNA甲基转移酶家族（DNMTs，DNMT1、DNMT3a和DNMT3b）的介导催化下，以S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine，SAM）作为甲基供体，共价结合1个游离的甲基形成5-甲基胞嘧啶的过程[20]。表观遗传学调控机制对细胞分化至关重要，这一过程在每个特定生物体的细胞水平是高度保守的，当这种高度保守的过程直接或间接地受到外部环境影响时，就会导致基因表达的改变，从而导致功能的改变[21]。
DNA甲基化主要决定基因的沉默，去甲基化的过程主要是基因表达的开始。目前，DNA甲基化已被证明可以通过调节基因表达而影响免疫细胞的功能发挥[22]。如在心衰患者血液中白细胞网蛋白由于DNA甲基化导致其表达量降低，加剧了病情发展[23]。PMNs作为一种主要的白细胞类型，其生理病理作用受特定基因的甲基化/去甲基化影响，决定其相应功能的执行。研究显示，乳腺癌微环境中存在一种特定的PMNs亚群：C5aR1阳性（C5aR1+PMNs），该亚群能够通过增加细胞外调节蛋白激酶1/2- WTAP依赖的ENO1 m6A甲基化诱导乳腺癌糖酵解，因而能够促进体内乳腺癌的生长[24]。Coit等[25]对狼疮患者PMNs全基因组DNA甲基化进行分析，结果表明PMNs总体甲基化程度较低，并且干扰素特征基因强烈的去甲基化可能是导致PMNs在狼疮中的致病原因。在PMNs颗粒形成过程中，Tet蛋白（Tet 1/2/3）通过将5-甲基胞嘧啶转化为5-羟基-甲基胞嘧啶来启动socs3b mRNA去甲基化从而使转录本不稳定，导致其下调，有利于PMNs成熟。在Tet 2/3双突变斑马鱼中，socs3b mRNA甲基化导致socs3b mRNA积累及细胞因子信号的抑制，影响PMNs吞噬功能[26]。大量相关研究均证实，有可能通过调节基因表达等手段影响免疫细胞功能表达，从而达到治疗目的。
口腔疾病中DNA甲基化致病机制的研究相当广泛。Towle等[27]认为异常甲基化在口腔癌癌变早期及晚期病变中均可发生，而高度甲基化则被认为是导致口腔癌发展的主要因素[28]。烟草等致癌物及其代谢产物通过改变DNA甲基转移酶的表达来促进基因的甲基化[29]。而p16蛋白作为抑制细胞周期G1期进展的调控因子，其甲基化与口腔上皮异常增生的恶性转化相关，是预测轻度或中度口腔上皮异常增生的潜在生物标志物。Liu等[30]发现以p16甲基化阳性标准作为早期预测癌症发展的生物标志物时，灵敏度和特异性分别为62%、76%。
口腔黏膜疾病等相关研究发现，口腔扁平苔藓与正常口腔黏膜相比，免疫应答相关基因的甲基化情况有所不同，口腔扁平苔藓中观察到DNA甲基转移酶表达增加，miR-137启动子区域也呈现高度甲基化特征[31,32]。口腔黏膜常见病复发性阿弗他溃疡病因复杂，目前尚无定论，多数认为细胞免疫功能下降及T淋巴细胞亚群失调可影响复发性阿弗他溃疡的病变进程，Bird等[33]研究表明，细胞因子以及转录因子在调控辅助性T细胞（helper T cell，Th）1及Th2细胞分化的同时，伴随着DNA甲基化表观遗传的修饰，协同调控Th1及Th2细胞分化。另有研究指出，分化后的Th2细胞分泌的IL-4伴随着IL-4基因"CpG"岛的去甲基化，同时Th1细胞肿瘤坏死因子G（tumor necrosis factor G，TNFG）表达的增加伴随着干扰素（interferon，IFN）-γ基因的低度甲基化状态[34]。
中性粒细胞PMNs在牙周炎中的双重作用，近年来愈加得到学者们的重视。DNA甲基化作为牙周病发生、发展的一种重要调控机制，针对两者的相关性研究目前主要集中在"CpG岛"位点。大部分管家基因的启动子区域，基因末端通常会存在某些富含双核苷酸"CG"的区域，被称为"CpG岛"，有研究证实80%~90%的"CpG岛"位点在人类DNA发生了甲基化，通过CpG甲基化水平增高，某些炎性因子如中性粒细胞等可促进各类牙周炎等发生[35]。另有研究认为，固有口腔存在的正常菌群中含有牙周致病菌，在病理状态下可刺激牙龈组织，由于牙龈上皮表面具有与中性粒细胞等固有免疫细胞类似的功能和受体成分，DNA甲基化对固有免疫细胞发育及功能产生了影响[36]，可促进牙周病的进程。目前在牙周炎中开展PMNs甲基化基因的相关研究结论较少，在类似研究中，慢性牙周炎患者的DNA甲基化特征与健康人的DNA甲基化特征相比，可能存在差异[37]。
目前对牙周炎组织相关免疫细胞进行DNA甲基化检测来探讨其致病机制的研究正成为当前热点，Gomes-Silva等[38]发现白细胞介素（interleukin，IL）-6在慢性牙周炎患者牙龈组织中有较高表达水平，同时发现IL-6基因启动子区域存在部分甲基化。Viana等[39]采用甲基化特异性聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）和DNA测序分析，分别对健康个体和慢性牙周炎患者的IFN-γ和IL-10基因的DNA甲基化状态进行检验，结果表明牙周组织编码IFN-γ和IL-10基因中存在甲基化。Zhang等[40]也发现牙周炎患者牙周组织中IFN-γ基因启动子区域内的低甲基化与IFN-γ基因转录表达的增加有关，并认为慢性牙周炎是一种不可逆转的牙周病，DNA甲基化可能是控制TNF-α表达的重要调控机制。
因此有研究认为，炎症位点的表观遗传调控可对机体局部免疫反应进行调控，所以在同一个体中炎症位点与非炎症位点的表观基因组存在差异。而表观遗传修饰不是永久性的，可以通过改变环境来逆转[41]，通过牙周基础治疗（如刮治术）清除病原细菌可能会改变炎性区域的表观基因组，达到治疗效果。中性粒细胞PMNs及相关免疫细胞DNA甲基化与牙周炎的作用机制还需进一步研究，采用生物信息学技术的方法分析牙周病相关PMNs的甲基化基因可能得出相关结论。
目前在牙周炎中开展PMNs甲基化基因的研究报道较少，对PMNs甲基化基因调控其功能在牙周炎中的机制还缺乏全面的了解。通过生物信息学技术手段鉴定潜在的甲基化调控基因在肿瘤预后领域得到了广泛应用。如Tan等[42]采用LASSO Cox回归和多变量Cox回归分析鉴定出4个与胰腺癌患者预后相关的DNA甲基化基因（GPRC5A、SOWAHC、S100A14和ARNTL2），基于这4个基因构建了risk score模型，该模型不仅具有可靠的预后评估能力，还能够用于预测患者的化疗、靶向治疗和免疫治疗的响应。Zhu等[43]对TCGA数据库和GEO数据库的综合分析鉴定出97个结直肠癌甲基化基因，并通过单变量Cox回归分析进一步筛选出与患者总生存率相关的4个甲基化基因（CBLN2、RBM47、SLCO4C1和TMEM220），在细胞实验中证实了CLBN2和TMEM220受其启动子区域甲基化的调控。
因此可通过生信分析公共数据库中牙周炎患者与健康人群牙周组织mRNA表达谱数据及DNA甲基化数据，挖掘关键的PMNs DNA甲基化基因，阐释该基因对于牙周炎病理进展的影响，并评估其诊断价值。在GEO数据库中以"periodontitis"为关键词检索、筛选合适的研究队列作为训练集和验证集。采用R语言分析训练集（GSE10334）中健康牙周和牙周炎患者牙周组织的DNA甲基化数据及差异表达基因。基于单细胞RNA测序数据分析健康牙周和牙周炎患者PMNs的差异表达基因。整合数据，采用Funrich软件做基因交集筛选在牙周炎病理状态下PMNs的DNA甲基化基因。采用STRING数据库对低甲基化高表达基因和高甲基化低表达基因构建蛋白质互作网络，以综合得分>0.4为阈值进行基因之间相互作用的筛选。所得的蛋白质互作网络利用软件Cytoscape 3.6.1中的cytohubba插件进行拓扑结构分析，来确定模块中的最重要核心基因。在验证集（GSE173078）中分析健康牙周和牙周炎患者牙周组织的PMNs甲基化基因的表达。
以选定的PMNs甲基化基因表达中值为标准，将GEO中研究队列分为高表达组和低表达组2个亚组。采用CIBERSORT软件计算2个亚组免疫细胞组成和比例。在2个亚组中分析巨噬细胞M2/M1比例、趋化因子及其受体（如CCL1~28、CXCL1~17、CCR1~10和CXCR1~6等）、免疫抑制细胞因子（TGF-β1、IL-10、VEGFA和ARG1）、干扰素和受体以及白细胞介素和受体（IFNAR2、IFNGR2、IL10RA、IL10RB、IL12、IL32和IL4R）mRNA差异表达。对2个亚组差异表达基因采用基因集富集分析其涉及的通路。
在训练集中采用受试者工作特征曲线评估PMNs甲基化基因的诊断准确性；在验证集中将样本分为侵袭性牙周炎和慢性牙周炎，采用受试者工作特征曲线评估PMNs甲基化基因对这2种牙周炎亚型诊断灵敏度。
本文总结了表观遗传机制可调控个体对组织炎症的反应，说明DNA甲基化是可能影响牙周组织细胞功能的潜在因素，由此开启基于生物信息技术手段，挖掘牙周炎病理状态下多形核中性粒细胞PMNs甲基化基因，通过分析该基因调控的网络通路，可阐释其对PMNs功能产生的潜在影响。通过分析PMNs甲基化基因与其他免疫细胞之间的关系，阐释PMNs甲基化基因对牙周组织免疫环境的影响。PMNs去甲基化或使DNA甲基化处于稳态，可能是预防和治疗早期牙周病的一种新方法。通过在GEO多个数据库中验证PMNs甲基化基因用于牙周炎诊断的灵敏度，可为牙周炎诊断及治疗提供新靶点和新策略。目前在牙周炎中开展PMNs甲基化基因的相关研究较少，依然缺少直接证据阐明其作用机制，还需进一步研究。
所有作者均声明不存在利益冲突
