人间充质干细胞（hMSCs）作为成体干细胞，具有自我复制更新及多向分化潜能，独特的生物学功能决定其广泛的临床适应症，研究者可根据临床预期目标定义hMSCs的质量属性，其质量研究一般应考虑hMSCs的微生物学安全性、生物学安全性、细胞生物学属性及生物学有效性。质量评价是针对hMSCs各质量属性所建立起的、具有共识性的各类物理、化学及生物学评价方法。传统产品安全性评价策略无法完全适应当下工艺和产品使用特性，研究者已结合当前技术开发有效评价的新方法；产品有效性评价策略根据临床预期用途并在质量研究基础上，已逐步建立和规范有效性评价体系，使研究者更全面评价不同阶段和工艺下的hMSCs产品。主要对人间充质干细胞质量研究及评价的研究进展进行综述，为发挥干细胞在再生医学领域的应用提供参考。
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人间充质干细胞（human mesenchymal stem cells，hMSCs）是一类具有一定自我复制更新和多向分化潜能，形态类似于成纤维细胞的成体干细胞，广泛存在于胎儿和成人各组织中，如新生儿脐带、胎盘、羊膜，成人牙髓、骨髓、脂肪等附属组织[1]。2006年国际细胞治疗学会建立了识别hMSCs种群的标准，并对hMSCs进行了定义[2]。随着hMSCs的质量研究及质量评价方法逐步深入和改进，干细胞再生医学离临床转化越来越近，但研发者对临床研究用hMSCs质量属性的认识以及质量研究存在不同，所使用hMSCs的来源、培养制备工艺和评价标准等都存在不同，质量属性及评价方法成为临床前研究首要解决的问题，也是整个细胞产品研发周期质量研究的主要内容。本文主要对人间充质干细胞质量研究及评价的研究进展进行综述，为发挥干细胞在再生医学领域的应用提供参考。
hMSCs具有丰富的生物学功能，包括分化潜能、免疫调控、组织再生功能，使其具有广泛的临床适用前景[1,2,3,4]，并成为细胞治疗领域中发展最为广泛、最为迅速的干细胞类型。国家药品监督管理局药品审评中心共受理了多款干细胞新药临床试验申请，分别用于治疗难治性急性移植物抗宿主病（acute graft-versus-host disease，aGVHD）、激素耐药的aGVHD、膝骨关节炎、类风湿关节炎、急性呼吸窘迫综合征、特发性肺纤维化和慢性加急性（亚急性）肝衰竭等[4]。目前可进入临床研究的细胞治疗产品一般有2个途径，包括制药企业按药物注册研发申报的细胞治疗临床试验和临床医生主导按医疗技术类备案的细胞治疗临床研究，国家食品药品监督管理局发布相关技术指南[5]。
为hMSCs能够持续稳定地满足临床研究及应用的质量要求，建议根据产品的预期目标定义产品质量属性，一般考虑hMSCs应具备微生物学安全性、生物学安全性、细胞生物学属性及生物学有效性。
微生物学安全性质量属性是指相关细胞满足无病毒污染、无菌、无热源的质量控制要求。其中病毒污染是指来源于供者或是制备工艺所引入的种属特异性外源（动物源）或内源（人源）病毒，外源病毒如牛源、猪源病毒，内源病毒如乙型肝炎病毒、艾滋病毒、梅毒等[4,5]，热源是指以革兰阴性菌所产生的内毒素。
生物学安全性质量属性是指其由其生物学特性所决定的，结合诱发其生物学特性发生改变相关的安全性问题。如评价hMSCs进入体后所产生的成瘤性和/或促瘤性、异常分化、异常免疫反应的生物学安全性问题[6,7]，2023年发布的《人源干细胞产品药学研究与评价技术指导原则》强调应特别关注的是高代次细胞[7]，其生物安全性风险较高。
细胞生物学属性是指包括细胞鉴别、活性、纯度和均一性等。其中细胞鉴别指相关细胞的形态学和细胞表面标志物，如hMSCs贴壁细胞呈长梭型生长，表达CD73、CD90、CD105[2]；细胞活性是指细胞活率、增殖周期和倍增时间等生物学特性[4]；细胞纯度和均一性是指在细胞制备过程中所引入的非相关细胞，以及相同来源、相同细胞类型在生物学特性方面的纯度和均一性，如利用个体遗传多态性或遗传指纹图谱来评价细胞的种属特征和种属间不同细胞交叉污染[4]。
生物学有效性质量属性是指根据临床研究将诱导分化功能、免疫调控能力及组织再生功能列为有效评价内容[7]。其中诱导分化功能主要是指在体外特定诱导分化条件下，细胞向目的细胞分化的能力，其中hMSCs强调诱导分化功能包括成骨、成脂、成软骨细胞的分化功能检测，并关注异常分化；免疫调控功能是指细胞释放免疫调控分子、抑制促炎性免疫细胞增殖或活性、促进调节性免疫细胞增殖或极化的功能，检测免疫调控因子等来表征[4,7]，并可评价异常免疫反应；组织再生功能是指干细胞所具有的保护组织细胞抗凋亡损伤、促进病损组织血管再生、刺激病损组织内源性干细胞增殖和分化的能力，相关指导原则指出可结合体内、体外实验评价[5]。
hMSCs的产品质量属性比较见表1。
hMSCs的产品质量属性比较
hMSCs的产品质量属性比较
| 质量属性 | 评价内容 |
|---|---|
| 微生物学安全性 | 无菌检测、支原体检测、特定病毒和非特定病毒检测、细菌内毒素检测 |
| 生物学安全性 | 成瘤性和促瘤性检测、异常免疫反应、残留物的检测 |
| 细胞生物学属性 | 细胞形态、个体遗传多态性或遗传指纹图谱-短串联重复序列、细胞表面标志物的检测、种属间细胞污染的检测、细胞活性、中期染色体核型分析 |
| 生物学有效性 | 多向分化功能的评价内容、免疫调控功能的评价内容、组织再生功能的评价内容 |
研究者需建立hMSCs产品的质量控制策略，一般应针对不同阶段关键制备工艺，包括组织采集，细胞分离、培养扩增、收获、放行，并制定相应的质量控制标准[5]。检定项目应当建立在产品质量研究以及对生产工艺和生产过程充分理解的基础之上，合理设置样品检测阶段，如中间样品、放行检测、留样样本等，以有效控制产品质量[4,5,6]。
质量评价技术是指针对hMSCs各质量属性所建立的具有共识性的各类物理、化学及生物学评价技术。产品研发或生产制备的不同阶段规范质量评价，并依据不同的质量控制目标，选择合理的评价技术或技术组合，组合产生合理的评价策略，对相关产品进行有效的质量评价，其根本目标是提高产品研发效率，提升产品质量的管理水平。
检测以病原体核酸检测为主，使用国家批准的体外诊断试剂盒进行检测，中国食品药品检定研究院建议干细胞制剂质量控制评价体系应考虑种属特异性外源（动物源）或内源（人源）病毒，并列举相关病毒[6]，检测项目主要包括人源病毒检测人类免疫缺陷病毒-1/2、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人类嗜T细胞病毒-1/2、EB病毒、巨细胞病毒、B19病毒、人类疱疹病毒、腺病毒和梅毒螺旋体，动物源一般考虑培养基携带牛源及猪源病毒[5,6]，检测一般采用指示细胞培养法加核酸方法。
可按照现行版药典所要求的培养法进行检测，还可采用全自动细菌/分枝杆菌检测系统进行无菌检测，上海市食品药品检验研究院对全自动细菌/分枝杆菌检测系统作为药典无菌测试的替代方法进行性能评估。对于特定细胞产品，使用标准菌株，研究表明检测谱和检测限与药典法相当，大多数情况下会2~3 d内报告阳性结果，同样在适用性方面，系统报告结果方面不劣于药典法[8,9]。无菌检测还可探索核酸检测方法，以利于细胞鲜活制剂终产品的快速放行。
检测可按照现行版药典中规定的培养法和指示细胞感染法（或称DNA染色法）相结合进行确证性支原体检测[4]，也可应用支原体核酸扩增方法作为快速放行方法，此方法具有快速、便捷等特点，但核酸扩增方法检测支原体能力依赖于扩增引物序列是否包含广泛的常见支原体，如常见人形支原体、解脲支原体和肺炎支原体，且不同提取方式、扩增体系都会影响检出率，而且无法鉴别样品中支原体是否存活，也因此局限性药监机构仍持谨慎态度，中国食品药品检定研究院建议研究者充分开展方法学验证[10]。
可使用药典所建议的凝胶法（凝胶限度和凝胶半定量）和光度测定法（比浊法和比色法），《中国药典》2020年版还收录基于重组C因子内毒素检测方法，重组因子C的细菌内毒素检测方法，此方法替代动物源鲎试剂且有抗干扰能力[11]。有研究比较了内毒素鲎试剂方法和重组C因子检测数据，结果显示2种方法的检测结果是可比的。裴宇盛等[12]使用对细菌内毒素重组C因子检测法（Lonza和Hyglos 2种试剂盒）的线性范围、准确度、精密性、专属性、检测限及耐用性进行验证，并与动态显色法进行比较。结果显示2种方法在内毒素标准品为0.005~5 EU/ml内与logδRFU均呈良好的线性关系，均r>0.980；高、中、低浓度内毒素标准品2种方法检测回收率的平均值差异均无统计学意义；精密度各有优劣，总体相当；重组C因子不与β-葡聚糖发生反应，动态显色法检测β-葡聚糖浓度为0.55 EU/ml；检测限均为0.005 EU/ml；斜率和实测值不受增益值改变的影响，截距和增益值呈正相关，重组C因子法具有良好的准确度、精密性、专属性及耐用性，可应用于生物制品的细菌内毒素检查。
成瘤性检查是为确定细胞基质在动物体内是否能够形成肿瘤，对细胞特性进行鉴定。成瘤性检查针对的是细胞基质。目前使用比较广泛的成瘤性检查方法有动物接种法（体内）和软琼脂克隆形成实验（体外）[13,14,15]。其中，体内法为评价的标准，但对某些细胞而言，体外法的结果也可以作为细胞成瘤性检查的参考，尤其是低代次、在动物体内无成瘤性的传代细胞系[13]。
致瘤性检查是指确定细胞基质中是否存在可使细胞永生化并具有形成肿瘤的因子，分析促或抑制瘤性。促或抑制瘤性检查针对的是细胞因子，细胞促或抑制瘤性研究是评价宿主细胞和细胞治疗产品发生肿瘤转化而引起的致瘤风险或抑瘤风险，传统研究方法不可行，建议细胞治疗产品体内促/抑检查实验可与较长周期动物毒理实验研究伴随开展，以此评价细胞或裂解物促进正常细胞转变为肿瘤细胞的能力，应使用临床终产品，不建议使用替代产品[16,17]。
常采用流式细胞术分析细胞的表型，2006年国际细胞治疗学会建立了识别hMSCs种群的标准，并对hMSCs进行定义，流式检测结果显示CD73、CD90及CD105高表达，CD14、CD34、CD45、CD79a及人类白细胞抗原-DR不表达或低表达[2,18]，张德双等[18]在人脐带hMSCs的体外获取、鉴定及标记均使用上述方法鉴别。
种属污染检测可采用短串联重复序列（short tandem repeat，STR）分型检测技术，对其进行准确鉴定，并确定是否存在细胞交叉污染[19,20,21]，孟淑芳等[21]使用PCR-毛细管电泳分析方法，在培养过程检测9、16个人STR位点的方法鉴别人源细胞，并对病毒性疫苗生产用人二倍体细胞株和基因治疗制品生产用的293细胞进行STR图谱的检测和比较，结果显示STR图谱分析灵敏度高、特异性强，可用于生产用人源细胞株/系的鉴别。
常用的显带技术是染色体G显带技术[22,23]，染色体的核型分析始于1968年的显带技术，至今已有50余年的历史，随着科技进步，新的检测技术不断涌现，如在20世纪80年代末发展出的荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH），21世纪的光谱核型分析（spectral karyotyping，SKY），近年来也有将高通量测序方法应用于染色体异常的检测。但FISH会受探针来源的限制，SKY及二代测序难以检测染色体的易位和倒位等[21]，而G显带技术则受到分辨率的限制，难以发现染色体的细微变异。对于染色体的核型分析，现有检测方法均有其技术上的局限性，但G显带这一经典方法在临床等领域至今仍有着不可替代的地位。
对hMSCs多向分化功能评价一般包括成骨细胞、成脂细胞和成软骨细胞，可使用相关诱导分化培养基，并经染色确认。此外，可根据临床适应症的不同，选择适应症相关的目标分化细胞，如肝上皮细胞、神经细胞、胰岛细胞、生殖细胞的分化功能进行评价[24,25,26,27]。非预期异常分化也应进行评价，细胞在体外操作过程中可能分化为非目的细胞。建议开发特定的检测技术，如高通量测序研究干细胞产品非预期分化的可能性和影响，可结合目的细胞分化效率进行具体分析[9]。
hMSCs的免疫调控功能表现为抑制免疫细胞释放炎症因子，抑制促炎性免疫细胞增殖活化和促进调节性免疫细胞增殖或极化，以及hMSCs细胞自身分泌不同类型免疫调控因子的能力[28]。具体评价内容可包括hMSCs抑制活化后的（异体）淋巴细胞增殖、抑制促炎的辅助性T淋巴细胞（Th1/Th17）增殖[27,28]和促进调节性T淋巴细胞（Treg）增殖或极化，同来源hMSCs促进Treg增殖的初级质量属性标准值为（47.9±23.3）%[29]。异常免疫学反应也应关注，hMSCs细胞自身免疫相容抗原人类白细胞抗原分子、免疫共刺激分子和促炎因子等表达进行检测，以及对活化的免疫细胞相关促炎因子（如干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α）释放效应进行检测。
对hMSCs促进组织细胞再生功能的评价包括旁分泌功能，其hMSCs细胞自身可分泌不同类型的生长因子促进组织损伤修复或再生[29,30,31]；抗凋亡功能，保护组织细胞抗凋亡损伤；促血管再生功能，促进细胞增殖和血管生成；促进巨噬细胞从M0型向M2型极化等[32,33,34]。
近年来，检测方法逐步完善，研究者可以更全面地评价不同阶段及工艺下的hMSCs产品，但传统安全性评价策略无法完全适应当下工艺和产品使用特性，如药典法的无菌检测、支原体检测无法实现快速放行，研究者已结合当前技术开发一系列有效评价的新方法，如全自动培养系统、PCR等技术；有效性评价在多年质量研究基础上正逐步建立和规范，中国食品药品检定研究院已对多向分化功能、免疫调控功能、组织再生功能进行了开发[27,28,29]，并总结生物有效性共识，逐步建立有效性评价体系。
本文主要对hMSCs质量研究内容及评价进展进行介绍，阐述质量研究方向应关注4大关键质量属性；并对常用的评价方法和应用进展进行说明。伴随hMSCs产品安全性、有效性研究的不断深入，检验评价方法的逐步完善，相关工艺信息逐渐获得累积，结合hMSCs的预期用途和制备工艺的相关风险，使hMSCs产品更能满足临床使用的质量控制要求；同时伴随细胞治疗产品法规的不断补充，其标准化、规范化的管理和使用，保障hMSCs细胞治疗性产品的质量，并成为细胞治疗领域代表性应用案例，发挥干细胞在再生医学领域中的潜质和广泛应用。
所有作者均声明不存在利益冲突
