探讨Ras相关C3肉毒素底物1/丝裂素活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶(Rac1/MAPK/ERK)信号通路在大鼠呼吸机相关性肺损伤(VILI)中的作用及其机制。
将30只SD大鼠按随机数字表法分为自主呼吸组、正常潮气量(VT)组和大VT组,每组10只。自主呼吸组大鼠保留自主呼吸;正常VT组和大VT组大鼠均行气管切开后气管插管,双肺分别给予6 mL/kg和40 mL/kg VT的机械通气并维持麻醉。通气4 h后处死大鼠取心脏血、支气管肺泡灌洗液(BALF)和肺组织。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定血清和BALF中白细胞介素(IL-1β、IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、髓过氧化物酶(MPO)及巨噬细胞炎症因子-2(MIP-2)水平。测定肺组织湿/干重比值(W/D);苏木素-伊红(HE)染色后,光镜下观察肺组织病理学改变,并进行病理学评分;透射电镜下观察Ⅱ型肺泡上皮细胞(AECⅡ)超微结构改变;采用免疫组化法检测肺组织磷酸化细胞外信号调节激酶(p-ERK)阳性表达,采用免疫荧光技术检测肺组织Rac1和F-肌动蛋白(F-actin)的阳性表达;采用实时荧光定量反转录-聚合酶链反应(RT-qPCR)检测肺组织ERK及Rac1的mRNA表达;采用蛋白质免疫印迹试验(Western Blot)检测肺组织Rac1、p-ERK及F-actin的蛋白表达。
①与自主呼吸组比较,机械通气两组肺W/D比值均明显升高,以大VT组升高更为显著(6.64±0.88比1.79±0.36,P<0.01)。②自主呼吸组肺组织及AECⅡ超微结构无明显病理学改变。正常VT组肺组织有轻微水肿及少量炎性细胞浸润;AECⅡ板层小体较少,细胞膜绒毛分布欠均匀。大VT组肺组织明显水肿,肺间隔增宽,肺泡充血,伴有大量炎性细胞浸润,肺泡结构紊乱;AECⅡ形态不规则,核固缩明显,胞质中板层小体数量减少且分布不均。大VT组肺组织病理学评分明显高于自主呼吸组和正常VT组(分:12.00±2.00比6.00±1.51、8.50±0.93,均P<0.01)。③与自主呼吸组比较,机械通气两组血清及BALF中IL-1β、IL-6、TNF-α、MPO、MIP-2水平均明显升高,以大VT组升高更为显著〔血清IL-1β(ng/L):104.2±15.1比20.3±8.3,IL-6(ng/L):46.6±11.5比22.7±7.5,TNF-α(ng/L):39.4±6.5比5.4±1.9,MPO(ng/L):0.66±0.24比0.06±0.03,MIP-2(ng/L):109.2±25.8比22.8±8.4;BALF中IL-1β(ng/L):121.5±25.6比24.0±7.5,IL-6(ng/L):136.7±32.7比31.4±10.5,TNF-α(ng/L):98.0±14.8比10.1±2.6,MPO(ng/L):0.80±0.31比0.08±0.04,MIP-2(ng/L):144.4±28.9比41.2±20.7;均P<0.01〕。④自主呼吸组仅有极少量p-ERK、Rac1和F-actin阳性表达;正常VT组阳性表达有所增加;大VT组p-ERK阳性表达明显增加,Rac1、F-actin分别分布于细胞膜和细胞质,阳性表达进一步增强。⑤大VT组ERK、Rac1基因和p-ERK、Rac1、F-actin蛋白表达量明显高于自主呼吸组和正常VT组〔ERK mRNA(2-ΔΔCt):8.23±2.83比1、3.02±1.38,p-ERK蛋白(灰度值):1.15±0.36比0.61±0.23、0.88±0.22;Rac1 mRNA(2-ΔΔCt):4.45±2.26比1、1.22±0.39,Rac1蛋白(灰度值):0.91±0.16比0.48±0.11、0.55±0.10;F-actin蛋白(灰度值):0.70±0.09比0.49±0.08、0.55±0.04;均P<0.01〕。
VILI模型大鼠肺组织F-actin表达明显上调,AECⅡ骨架重构和细胞膜通透性改变,推测F-actin可能通过激活Rac1/MAPK/ERK信号通路加重VILI。






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机械通气(MV)是临床救治各种原因所致机体氧合功能障碍的必要措施,长时间机械牵张可引起肺毛细血管内皮细胞及肺泡上皮细胞(AEC)结构和功能改变、肺泡及间质水肿,继而激活体内炎症信号通路,最终导致呼吸机相关性肺损伤(VILI)。Ras相关C3肉毒素底物1(Rac1)是G蛋白Ras超家族Rho亚家族的一类小分子GTP蛋白酶,参与细胞迁移、肌动蛋白重组、肿瘤侵袭转移、转录因子调节及血管内皮生成等过程,尤其对细胞骨架构成、伪足形成和方向性运动具有中心调节作用。机械牵拉可引起细胞骨架蛋白重塑,随着牵拉幅度和频率增大而使AEC通透性增加,导致上皮细胞屏障功能障碍,从而激活Rho信号通路。Rac1蛋白对机体内炎性细胞,主要是中性粒细胞的趋化作用具有重要影响,并与AEC迁移、骨架蛋白重构及细胞间紧密连接形成有密切联系。本实验通过建立大鼠VILI模型,探讨Rac1蛋白在VILI发病中的作用及其机制。