哮喘是一种复杂的异质性疾病，频繁急性发作严重影响患者生活质量，并造成沉重的经济负担。近年来，血清生物标志物的发展为实现哮喘精准化治疗和难治性哮喘的诊治提供了新思路。
分析不同分期哮喘患者与健康人群血清生物标志物的分布差异，探究血清生物标志物识别急性发作的潜能。
采用横断面研究，以2018年11月至2020年12月河南中医药大学第一附属医院收治的293例哮喘患者为研究对象，根据哮喘分期分为急性发作期组155例，非急性发作期组138例；同期在医院体检中心招募健康志愿者39例，纳入健康志愿者组。运用ELISA法分别检测三组的血清生物标志物〔白介素4（IL-4）、白介素6（IL-6）、白介素8（IL-8）、白介素17（IL-17）、干扰素γ（IFN-γ）、转化生长因子β2（TGF-β2）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、总免疫球蛋白E（TIgE）、特异性免疫球蛋白E（SIgE）、嗜酸性粒细胞趋化因子（Eotaxin）、嗜酸性粒细胞阳离子蛋白（ECP）、骨膜蛋白（Periostin）、白三烯D4（LTD4）、高迁移率族蛋白B1（HMGB1）、几丁质酶3样蛋白1（YKL-40）〕水平并比较。
急性发作期组、非急性发作期组血清IL-4、IL-6、IL-8、IL-17、TGF-β2、TNF-α、HMGB1、TIgE、SIgE水平均高于健康志愿者组（P<0.05）；急性发作期组、非急性发作期组血清IFN-γ水平低于健康志愿者组（P<0.05）；急性发作期组血清Eotaxin、YKL-40水平高于非急性发作期组和健康志愿者组，非急性发作期组Eotaxin、YKL-40水平高于健康志愿者组（P<0.05）；非急性发作期组Periostin水平低于健康志愿者组（P<0.05）。
血清IL-4、IL-6、IL-8、IL-17、IFN-γ、TGF-β2、TNF-α、SIgE、TIgE、HMGB1与哮喘疾病可能相关，但其表达水平可能与疾病分期无关。Eotaxin、YKL-40可能具有识别哮喘急性发作的潜能。
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支气管哮喘（以下简称哮喘）是由多种细胞及细胞组分参与的慢性气道炎症疾病，其发病机制复杂、临床表型多样、病情严重程度不一，是一种复杂的异质性疾病。根据临床表现可将其划分为急性发作期、慢性持续期和临床控制期[1，2]。2019年中国肺健康研究（CPH）调查结果显示：我国20岁以上人群中，哮喘的患病率为4.2%，患者总数达4 570万例，其中15.5%的患者存在1次以上的急诊就诊，7.2%的患者前一年内因哮喘急性发作而住院治疗的次数≥1次[3]。频繁的急性发作会加速肺功能恶化、加快疾病进展、降低生活质量，并消耗额外的医疗资源，造成严重的社会经济负担，是哮喘致残、致死的重要原因[1]。然而，长期以来，哮喘诊断和治疗方案的制订主要依据患者症状、病史以及肺功能检查等，由于患者缺乏对疾病的了解，常简单地认为是感冒或者支气管炎，低估了疾病风险，普遍存在未被诊断及治疗不足的情况。近年来，临床研究发现了许多血清生物标志物，用于哮喘诊断、不同表型的识别、疗效评价，以及对患者气道炎症、炎症类型等的预测，诊疗方案[4，5]。但是既往研究多以健康人群为对照提出单个血清生物标志物，缺乏对不同分期哮喘患者血清标志物灵敏度、特异度的研究，临床指导意义有限。因此，本研究探索性的通过对多个血清生物标志物进行检测，以期更加全面地解析患者病情、反映患者真实状况，从而为哮喘的诊断、分型、治疗和疗效评价提供更有临床价值的信息。
选取2018年11月至2020年12月河南中医药大学第一附属医院门诊及住院部收治的哮喘患者为研究对象，同时招募同期于医院体检中心体检的健康志愿者。
本研究为横断面研究，研究方案通过河南中医药大学第一附属医院伦理委员会审查（批号：2019HL-034），并在美国临床试验注册中心注册（注册号：NCT04128111）。所有研究对象在参加研究前已充分了解本研究的相关情况，并签署知情同意书。
参考《支气管哮喘防治指南（2016年版）》[6]和《支气管哮喘急性发作评估及处理中国专家共识》[7]，根据患者的临床症状/体征、可变气流受限的客观检查（支气管舒张/激发试验，呼气流量峰值昼夜变异率）等进行诊断。
（1）急性发作期：喘息、气促、咳嗽、胸闷等症状突然发生，或原有症状加重，并以呼气流量降低为其特征，常因接触变应原、刺激物或呼吸道感染诱发；（2）慢性持续期：每周均不同频率和/或不同程度地出现喘息、气促、胸闷、咳嗽等症状；（3）临床控制期：患者无喘息、气促、胸闷、咳嗽等症状4周以上，1年内无急性发作，肺功能正常。
参考世界卫生组织（WHO）关于"健康"的概念，并排除既往明确有其他疾病者。
（1）符合哮喘诊断的患者及健康体检人群；（2）年龄18~80岁；（3）入选前1个月内未参加其他临床研究；（4）自愿参加本研究。
（1）哮喘急性发作期伴发呼吸衰竭、行机械通气者；（2）意识不清、痴呆、各种精神病者；（3）合并血液肿瘤、严重心血管疾病（急性心肌梗死，心功能3级及以上）及严重肝肾疾病（严重肝脏疾病是指肝硬化、门脉高压和静脉曲张出血，严重肾脏疾病包括透析、肾移植）者；（4）正在参加其他临床试验者。
本研究所纳入研究对象均为门诊或住院的哮喘患者，绝大部分患者近期内有不同程度的哮喘症状发生，故本研究将哮喘症状突然发作或加重、需要住院治疗的患者归为急性发作组，而将症状轻微、在门诊口服药物治疗即可的慢性持续期和临床控制期哮喘患者归为非急性发作期组，并将同期在体检中心招募的健康人群归为健康志愿者组。共招募到390例哮喘患者，由于患者未达到空腹8 h以上或不愿留取标本等原因，最终收集血液标本293例，故本研究最终纳入293例哮喘患者，其中急性发作期组155例，非急性发作期组138例，健康志愿者组39例。收集三组人群的性别、年龄等一般资料及血清生物标志物。
于患者就诊当天采集空腹外周静脉血5 ml，室温静置2 h后放入低温离心机（仪器品牌Eppendorf，Centrifuge 5810R型号，离心温度4℃，离心转速3 000 r/min，离心时间10 min，离心半径35 cm）获取血清，分装后放入-80 ℃冰箱冷冻待测。标本检测由郑州点睛科技有限公司进行，采用ELISA酶联免疫吸附法测定血清生物标志物，所有流程按试剂盒说明书操作并出具检测报告。
（1）细胞因子：白介素4（IL-4）、白介素6（IL-6）、白介素8（IL-8）、白介素17（IL-17）、干扰素γ（IFN-γ）、转化生长因子β2（TGF-β2）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）；（2）免疫球蛋白：总免疫球蛋白E（TIgE）、特异性免疫球蛋白E（SIgE）；（3）嗜酸粒细胞型炎症：嗜酸性粒细胞趋化因子（Eotaxin）、嗜酸性粒细胞阳离子蛋白（ECP）；（4）血清炎性递质：骨膜蛋白（Periostin）、白三烯D4（LTD4）、高迁移率族蛋白B1（HMGB1）、几丁质酶3样蛋白1（YKL-40）。
（1）哮喘患者必须持有3个月内的支气管舒张或激发试验阳性结果；（2）标本采集人员在正式留取标本前，均需由资深的检验师对操作流程进行统一培训和考核；（3）若患者未达到空腹8 h以上或不愿留取标本，则放弃采样；（4）标本的检测由指定的专业检测机构进行，避免因仪器设备、试剂等不同造成的偏差。
使用SPSS 25.0统计学软件进行数据分析。不符合正态分布的计量资料以M（Q25，Q75）表示，多组间比较采用非参数检验（Kruskal-Wallis H test），组间两两比较采用两独立样本非参数检验（Mann-Whitney U Test）；计数资料以相对数表示，组间比较采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
三组性别、年龄比较，差异无统计学意义（P>0.05），见表1。
三组间性别、年龄比较
Comparison of gender ratio and mean age between acute and non-acute attack asthma patients and healthy physical examinees
三组间性别、年龄比较
Comparison of gender ratio and mean age between acute and non-acute attack asthma patients and healthy physical examinees
| 组别 | 例数 | 性别〔n（%）〕 | 年龄〔M（Q25，Q75），岁〕 | |
|---|---|---|---|---|
| 男 | 女 | |||
| 急性发作期组 | 155 | 62（40.0） | 93（60.0） | 48.0（36.0，56.0） |
| 非急性发作期组 | 138 | 52（37.7） | 86（62.3） | 46.0（34.0，59.0） |
| 健康志愿者组 | 39 | 19（48.7） | 20（51.3） | 48.0（30.0，58.0） |
| χ2（H）值 | 1.543 | 0.843a | ||
| P值 | 0.462 | 0.656 | ||
注：a为H值
急性发作期组、非急性发作期组、健康志愿者组血清IL-4、IL-6、IL-8、IL-17、IFN-γ、TGF-β2、TNF-α水平比较，差异有统计学意义（P<0.05）；其中急性发作期组、非急性发作期组血清IL-4、IL-6、IL-8、IL-17、TGF-β2、TNF-α水平高于健康志愿者组，差异均有统计学意义（P<0.05）；急性发作期组、非急性发作期组血清IFN-γ水平低于健康志愿者组，差异均有统计学意义（P<0.05）；但急性发作期组与非急性发作期组IL-4、IL-6、IL-8、IL-17、IFN-γ、TGF-β2、TNF-α比较，差异均无统计学意义（P>0.05），见表2。
三组血清生物标志物的比较〔M（Q25，Q75）〕
Comparison of serum biomarkers between acute and non-acute attack asthma patients and healthy physical examinees
三组血清生物标志物的比较〔M（Q25，Q75）〕
Comparison of serum biomarkers between acute and non-acute attack asthma patients and healthy physical examinees
| 组别 | 例数 | 细胞因子（pg/ml） | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| IL-4 | IL-6 | IL-8 | IL-17 | IFN-γ | TGF-β2 | TNF-α | ||
| 急性发作期组 | 155 | 15.41（12.33，24.94）a | 6.57（4.90，10.62）a | 9.14（7.65，10.57）a | 12.19（9.46，21.00）a | 8.05（4.55，13.95）a | 1 952.70（1 720.43，2 476.61）a | 73.20（46.20，327.28）a |
| 非急性发作期组 | 138 | 15.35（11.62，23.38）a | 6.38（4.90，10.62）a | 8.38（7.03，9.72）a | 11.60（9.30，19.52）a | 8.16（5.98，14.21）a | 1 892.21（1 665.35，2 412.73）a | 71.74（45.53，166.26）a |
| 健康志愿者组 | 39 | 5.75（5.11，7.54） | 2.94（2.31，3.76） | 2.26（1.53，3.03） | 3.25（2.15，7.46） | 25.26（16.26，41.58） | 1 354.11（1 298.97，1 509.81） | 29.03（22.37，48.00） |
| H值 | 68.827 | 49.632 | 103.821 | 69.078 | 54.705 | 66.968 | 33.975 | |
| P值 | <0.001 | <0.001 | <0.001 | <0.001 | <0.001 | <0.001 | <0.001 | |
| 组别 | 免疫球蛋白（μg/L） | 嗜酸粒细胞型炎症 | 血清炎性递质（μg/L） | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| TIgE | SIgE | Eotaxin（ng/L） | ECP（μg/L） | Periostin | LTD4 | HMGB1 | YKL-40 | |
| 急性发作期组 | 152.55（50.48，429.48）a | 98.68（28.37，137.95）a | 28.27（19.82，46.80）ab | 14.68（10.72，20.26） | 2 035.64（1 789.30，2 267.86） | 5.05（1.85，13.21） | 13.51（8.09，21.03）a | 248.33（161.81，334.84）ab |
| 非急性发作期组 | 107.44（38.57，323.19）a | 92.51（27.30，135.24）a | 22.78（16.04，32.45）a | 13.60（10.71，21.19） | 2 014.64（1 744.65，2 316.86）a | 5.63（1.59，14.21） | 11.20（6.78，17.10）a | 191.61（133.99，294.98）a |
| 健康志愿者组 | 14.62（10.33，23.25） | 12.94（4.94，19.12） | 14.53（7.08，23.10） | 11.64（9.23，17.83） | 2 216.04（1 842.18，2 964.45） | 3.53（2.69，5.44） | 7.07（5.89，10.10） | 132.02（88.53，178.99） |
| H值 | 79.905 | 53.784 | 26.823 | 4.253 | 6.596 | 2.468 | 24.052 | 36.617 |
| P值 | <0.001 | <0.001 | <0.001 | 0.119 | 0.037 | 0.291 | <0.001 | <0.001 |
注：a表示与健康志愿者组比较，P<0.05；b表示与非急性发作期组比较，P<0.05；IL-4=白介素4，IL-6=白介素6，IL-8=白介素8，IL-17=白介素17，IFN-γ=干扰素γ，TGF-β2=转化生长因子β2，TNF-α=肿瘤坏死因子α，TIgE=总免疫球蛋白E，SIgE=特异性免疫球蛋白E，Eotaxin=嗜酸性粒细胞趋化因子，ECP=嗜酸性粒细胞阳离子蛋白，Periostin=骨膜蛋白，LTD4=白三烯D4，HMGB1=高迁移率族蛋白B1，YKL-40=几丁质酶3样蛋白1
急性发作期组、非急性发作期组、健康志愿者组血清TIgE、SIgE水平比较，差异有统计学意义（P<0.05）；其中急性发作期组、非急性发作期组血清TIgE、SIgE水平高于健康志愿者组，差异均有统计学意义（P<0.05）；但急性发作期与非急性发作期组血清TIgE、SIgE水平比较，差异无统计学意义（P>0.05），见表2。
急性发作期组、非急性发作期组、健康志愿者组血清Eotaxin水平比较，差异有统计学意义（P<0.05）；其中急性发作期组血清Eotaxin水平高于非急性发作期组和健康志愿者组，非急性发作期组血清Eotaxin水平高于健康志愿者组，差异均有统计学意义（P<0.05）；急性发作期组、非急性发作期组、健康志愿者组血清ECP水平比较，差异无统计学意义（P>0.05），见表2。
急性发作期组、非急性发作期组、健康志愿者组血清Periostin、HMGB1、YKL-40水平比较，差异有统计学意义（P<0.05）；其中非急性发作期组血清Periostin水平低于健康志愿者组，急性发作期组、非急性发作期组血清HMGB1、YKL-40水平高于健康志愿者组，急性发作期组血清YKL-40水平高于非急性发作期组，差异有统计学意义（P<0.05）；急性发作期组与非急性发作期组血清Periostin、HMGB1水平比较，差异无统计学意义（P>0.05）。急性发作期组、非急性发作期组、健康志愿者组血清LTD4水平比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。
血清生物标志物是一种能够客观测量和评价正常生理过程、疾病进程以及治疗反应的指标[8]。哮喘生物标志物的出现，从新的角度诊断、评估哮喘状态，定义哮喘表型，为哮喘的靶向治疗提供了希望。当前，已经从哮喘患者血清中发现了许多血清生物标志物，用于哮喘的诊断、不同表型的识别、疗效评价等方面，优化了诊疗方案。然而，由于灵敏度、特异度等有限，迄今为止，无任何血清生物标志物被批准用于临床诊疗实践，也无任何血清生物标志物被写进哮喘诊疗指南[5]。随着生物医学的发展，未来可能会鉴定出更多的单个血清生物标志物。因此识别出具有更高灵敏度、特异度的血清生物标志物，对于指导临床实践十分重要。本研究采用横断面研究，探索性地对不同分期哮喘患者的血清生物标志物进行检测，可为进一步深入研究血清生物标志物的临床应用提供参考。
哮喘发病主要表现为辅助性T淋巴细胞1（Th1）功能低下和辅助性T淋巴细胞2（Th2）功能亢进。其中IFN-γ和IL-4分别是Th1和Th2的特征性细胞因子，IFN-γ参与抗炎反应，对机体产生保护作用，而IL-4参与形成气道炎症，导致哮喘的发病。IFN-γ可加速辅助性T淋巴细胞0（Th0）向Th1分化，抑制IL-4的分泌；而IL-4可加速Th0向Th2分化，抑制IFN-γ的分泌[9，10]。正常情况下，IFN-γ和IL-4之间相互制约和影响，以维持Th1/Th2的动态平衡[11]。哮喘发病时，Th1功能低下，IFN-γ分泌减少，Th2细胞功能亢进，IL-4分泌增多，从而加剧气道炎症。本研究结果显示，相对于健康志愿者组，急性发作期组、非急性发作期组哮喘患者IL-4水平升高，IFN-γ水平降低，但急性发作期组与非急性发作期组比较无明显差异。张趁英等[12]研究发现相对于健康对照组，非急性发作组、急性发作组哮喘患者，IL-4水平升高，IFN-γ水平降低，且急性发作期组变化更明显。本研究结果与之不完全相符，分析原因可能为：张趁英等[12]研究排除了近期接受免疫抑制剂（包含糖皮质激素）治疗的患者，而本研究部分患者为控制哮喘症状，使用了吸入性糖皮质激素（ICS），可能对结果造成影响。在慢性气道炎症时，IL-17细胞表达异常，诱导IL-6、IL-8生成，从而加重中性粒细胞气道炎症[13]。本研究结果显示，急性发作期组、非急性发作期组血清IL-6、IL-8、IL-17、TGF-β2、TNF-α水平高于健康志愿者组。TANG等[14]研究发现急性发作期哮喘患儿IL-6和IL-17水平较非急性发作期和健康对照组升高。LIU等[15]研究发现急性发作期组TNF-α和IL-8水平高于非急性发作期组和健康志愿组。LV等[16]研究发现与健康对照组相比，哮喘急性发作和非急性发作期患者血清IL-17水平显著升高。与既往研究相比，本研究上述细胞因子类血清生物标志物在急性发作期组和非急性发作期组之间无明显差异，分析原因可能为：TANG等[14]研究对象为儿童哮喘患儿，而本研究纳入研究对象均为成人患者；LIU等[15]研究要求患者在入组前4周内未使用类固醇类药物治疗，本研究对此则不作限制，由此造成结果差异的可能性较大。
在过敏性哮喘患者中，血清SIgE和TIgE检测是明确过敏原最重要的手段，SIgE/TIgE比值还可预测脱敏治疗的效果[17]。本研究结果显示，血清SIgE、TIgE水平急性发作期组、非急性发作期组高于健康志愿组，但急性发作期组与非急性发作期组组间比较无明显差异。LL等[18]研究发现哮喘非急性发作期组血清IgE水平较健康对照组明显升高。XUE等[19]研究发现哮喘患儿急性发作期组和非急性发作期组患者的血清IgE水平也明显高于健康志愿组，本研究结果与之一致，说明哮喘患者在急性发作期和非急性发作期均存在免疫失衡，但是血清SIgE、TIgE在哮喘急性发作期和非急性发作期之间的差异有待进一步研究。
ECP是嗜酸粒细胞的主要基质，可以判断哮喘炎性程度及预后，监测和指导临床抗炎治疗[20，21]。本研究结果显示，血清ECP水平在三组间比较无明显差异。JIANG等[22]研究发现，与健康对照组相比，哮喘急性发作期和非急性发作期患者的ECP水平更高，本研究结果与之不符，分析原因可能为：JIANG等[22]研究患者在入组前3个月内未接受全身激素、免疫球蛋白或免疫抑制剂治疗，并且排除了近期发生感染性疾病的患者，而本研究为寻找灵敏度、特异度更高的血清生物学指标，对此只是进行详细记录用药情况，并不排除此类患者，由此可能对ECP水平造成影响。Eotaxin是一种嗜酸粒细胞特异性CC趋化因子，在哮喘发作期间，作用于嗜酸粒细胞上的CC趋化因子受体3（CCR3），刺激嗜酸粒细胞迁移到肺组织中[16]。本研究结果显示，急性发作期组血清Eotaxin水平高于非急性发作期组和健康志愿者组，非急性发作期组血清Eotaxin水平高于健康志愿者组。LIU等[23]研究发现Eotaxin水平与哮喘急性发作及其严重程度密切相关，Eotaxin可能是哮喘患者潜在的治疗靶点，本研究结果与之一致，提示血清Eotaxin在哮喘疾病中具有重要作用，且血清Eotaxin可能是鉴别哮喘急性发作期和非急性发作期的生物标志物。
YKL-40是一种炎症标志物，参与哮喘的气道重构和组织纤维化过程，并与哮喘严重程度、上皮下基底膜厚度及肺功能呈正相关[24，25]。本研究结果显示，血清YKL-40水平急性发作期组高于非急性发作期组，非急性发作期组高于健康志愿者组。SPECJALSKI等[26]研究发现哮喘患者YKL-40水平明显高于健康对照组，并与疾病控制水平、肥胖等临床特征有关，本研究结果与之一致，提示血清YKL-40可能是鉴别哮喘急性发作期和非急性发作期的生物标志物。HMGB1可通过诱导Th2功能亢进，加剧急性变应性哮喘气道中的嗜酸粒细胞炎症，被认为是哮喘慢性气道功能障碍的标志物之一[27]。本研究结果显示，急性发作期组、非急性发作期组血清HMGB1水平高于健康志愿者组，但急性发作期与非急性发作期组间无明显差异。柴景伟等[28]研究发现急性发作期和非急性发作期哮喘患者HMGB1水平高于健康对照组，且急性发作期升高更显著，本研究结果与之不完全相符，分析原因可能为：柴景伟等[28]研究患者在入组2周内均未使用过支气管舒张剂，且三组间样本量大致相等，与本研究有所区别。Periostin表达水平升高与哮喘严重程度、活动度有关。本研究结果显示，非急性发作期组Periostin水平低于健康志愿者组，而急性发作期组与非急性发作期组、急性发作期组与健康志愿者组比较，无明显差异。薛磊等[29]研究发现，急性发作期组和非急性发作期组哮喘患儿血清Periostin水平均显著高于健康志愿组，且急性发作期组高于非急性发作期组，本研究结果与之不符，分析原因可能为：薛磊等[29]研究对象为来自我国西部地区（陕西、青海、甘肃三省）的哮喘患儿，并排除了具有哮喘家族遗传病史和肺部感染的患儿，本研究对象主要是来自河南省内的成人哮喘患者，两者在地域、年龄、家族史等方面存在差异。LTD4是哮喘发病过程中主要的炎性递质，不仅能促进炎性反应细胞在呼吸道内聚集，还可加快气道炎性反应发生、平滑肌挛缩等[30]。本研究结果显示，血清LTD4水平在三组间无明显差异。马乐萍等[31]研究发现急性发作期组和非急性发作期组哮喘患儿血清LTD4水平均高于健康对照组，且急性发作期血清LTD4水平高于非急性发作期，本研究结果与之不符，分析原因可能为：马乐萍等[31]研究中三组患儿的LTD4水平均高于本研究中三组的LTD4水平，且健康对照组儿童的LTD4水平已高于本研究急性发作期组哮喘患者的LTD4水平，存在年龄表达差异的可能性较大，结果有待进一步研究。
综上所述，本研究通过对多个血清生物标志物进行检测发现，血清IL-4、IL-6、IL-8、IL-17、IFN-γ、TGF-β2、TNF-α、SIgE、TIgE、HMGB1与哮喘疾病可能相关，但其表达水平可能与疾病分期无关。血清Eotaxin、YKL-40可能是鉴别哮喘急性发作期和非急性发作期的生物标志物。总而言之，血清生物标志物的出现为哮喘诊断、评估和疗效评价提供了一种可靠的、非侵入性的方法，但在不断探索新的血清生物标志物的过程中，也应加强对已有血清生物标志物灵敏度、特异度的研究，为临床实践提供更有指导性的信息。
（1）本研究为横断面研究，病例来源为单中心，样本量较小，且均为成人哮喘患者，不能代表整个哮喘群体；（2）受试者哮喘分级、既往用药等情况的差异，可能会对结果产生影响；（3）目前国内外关于血清生物标志物的研究结果尚无定论，本研究结果亦有待进一步验证。
本文无利益冲突。
