细菌耐药现象十分严重，已成为全球共同面临的难题。常规细菌耐药性检测方法，如纸片法、稀释法等不仅耗时长且无法明确具体的耐药机制，不能满足临床对药物敏感性指导的需求。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)用于细菌耐药性和耐药机制的检测，克服了传统方法的缺点，具有广阔的应用前景。本文将对近年来MALDI-TOF MS在细菌耐药机制检测中的方法及其适用范围作一阐述。
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当前，细菌耐药呈多重性趋势且形式多样、变化迅速，而新药的研发速度往往滞后于细菌耐药性产生的速度，因而耐药机制的快速检测具有重要意义[1,2,3]。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)是20世纪80年代发明并发展起来的生物大分子分析方法，通过蛋白质指纹图谱比对，可以对临床微生物实验室的细菌和真菌进行精确鉴定[4]。而MALDI-TOF MS用于细菌耐药机制的检测，不仅操作方便、通量高、耗时短，而且具有很高的特异度、灵敏度、分辨率和稳定性，是目前耐药机制研究领域的一大热点。本文将从以下七个方面阐述MALDI-TOF MS在细菌耐药机制检测中的应用。
敏感和耐药菌株各自表达的特异性蛋白，在质谱图中会有其对应的特征性图谱，将敏感和耐药菌株的质谱图谱进行比对，找到各自的特征性图谱及其对应的特异性蛋白，就可以将敏感和耐药菌株进行区分。Edwards-Jones等[5]应用MALDI-TOF MS研究甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌(MRSA)和敏感金黄色葡萄球菌(MSSA)时发现，525、617、734、760、787、798和826 m/z质谱峰在MRSA和MSSA中均存在，但891、1 140、1 165、1 229和2 127 m/z质谱峰只存在于MRSA中，而2 548和2 647 m/z质谱峰则只存在于MSSA中。Majcherczyk等[6]研究指出，MALDI-TOF MS能够根据不同耐药菌株具有不同特征性质谱图谱而区分基因型相同的敏感和耐药菌株。通过特征性质谱峰的检测除了可以识别耐药菌株外，还可以区分耐药菌株的来源。一项研究发现[7]，MRSA和万古霉素中介金黄色葡萄球菌的1 774.1 m/z和1 792.1 m/z两个峰对应的两种多肽存在于大多数社区获得性MRSA中，而医院获得性MRSA中则几乎没有。因此可以将敏感和耐药菌种中存在的这种特征性蛋白作为各自的生物标志物，用于临床高危耐药菌株的快速筛查，为临床感染患者的早期隔离和及时的抗菌治疗提供重要依据。
β-内酰胺酶是能够水解β-内酰胺环酰胺键的一类灭活酶，根据β-内酰胺酶分子结构中氨基酸序列的差异，可将β-内酰胺酶分成A、B、C、D四类，根据活性作用位点不同，又可将其分为丝氨酸酶(A、C、D类)和金属酶(B类)。检测β-内酰胺酶的常见方法有以下四种：改良Hodge试验、EDTA协同试验、分光光度法和分子遗传学技术。近几年，质谱技术被越来越多的用于β-内酰胺酶活性的检测。
目前，在利用质谱检测β-内酰胺酶活性的研究中，最常用的方法为水解法，其基本原理[8]为：待检菌株与某种抗生素在一定温度下(通常为37℃)共同孵育一定时间(30～180 min)，如果菌株产水解酶(如β-内酰胺酶)，就会将抗生素分子水解，水解会导致抗生素的分子量发生变化，而一些抗生素(如美罗培南)在水解后会发生脱羧反应，导致分子量的进一步改变，MALDI-TOF MS可以检测出抗生素水解或脱羧产物相对于其原始分子量的变化，从而间接证明待检菌株产水解酶并对该抗生素抵抗。
近年来，在该原理的基础上，实验方法得到不断改进，使得实验的敏感性和特异性也随之增加。Hrabák等[9]将美罗培南溶解液与过夜培养的细菌混合孵育3 h后，将反应混合物离心，用MALDI-TOF MS检测上清液，并将383 m/z和/或405 m/z峰的消失定义为菌株产碳青霉烯酶，检测的敏感度和特异度分别为96.67%和97.8%。接着，他们又将此方法进行了改进[10]——在反应混合物中加入SDS缓冲液，这一改进使得实验所需菌量减少，并且孵育时间减少至2 h。2015年，Lasserre等[11]进一步将实验方法进行改进：(1)水解底物换为亚胺培南；(2)计算MS比值——亚胺培南水解产物峰值/(亚胺培南水解产物峰值＋亚胺培南峰值)，建立产碳青霉烯酶和不产碳青霉烯酶肠杆菌科细菌之间MS比值的临界值，最终确定当MS比值≥0.82时，确定为产碳青霉烯酶菌株，而不是简单以特征峰的消失和/或出现作为判定标准。该方法的灵敏度和特异度分别为99%(1株产OXA-204菌株产生假阴性)和100%。由于OXA类碳青霉烯酶对碳青霉烯类抗生素的水解能力较弱，传统实验方法检出率低，MS比值法不仅能很好地鉴别产碳青霉烯酶与不产碳青霉烯酶的细菌，还可以有效检出OXA类碳青霉烯酶，增加了实验的敏感性。而Papagiannitsis等[12]在反应缓冲液中加入一定量的NH4HCO3后，就可以将检测OXA-48类碳青霉烯酶的敏感度增加到100%。此外，Kempf等[13]的研究指出，如果亚胺培南在300.0 m/z的特异性质谱峰消失，并且通过计算亚胺培南峰下面积与其降解产物峰下面积的比值<0.5，从而证明其降解产物特异性质谱峰254.0 m/z增加，则能够判断该鲍曼不动杆菌产碳青霉烯酶。而Álvarez-Buylla等[14]在碳青霉烯酶水解底物中加入吡啶二羧酸或锌离子，通过此方法，就可以区分金属β-内酰胺酶与苯唑西林酶。
MALDI-TOF MS水解法检测β-内酰胺酶活性已成功用于对氨苄西林、哌拉西林、头孢曲松和头孢他啶耐药的肠杆菌科细菌[8]，产SPM-1、GIM-1和GES-5的铜绿假单胞菌以及产OXA-143、IMP-10和OXA-58的鲍曼不同杆菌的检测[15]。此外，该方法还可用于产NDM-1、VIM-1、VIM-2、KPC-2、KPC-3、IMP-1、IMP-2、IMP-7、IMP-8、IMP-16、OXA-48和OXA-162[10,16]型碳青霉烯酶细菌的检测。
MALDI-TOF MS水解法检测耐药菌株速度快、成本低，但是该方法只适用于可以产酶并水解抗生素的耐药菌，对于抗生素结合位点改变和外排泵过表达等其他机制导致耐药的细菌，该方法则不适用。
氨基糖苷类抗生素可通过与细菌核糖体30S小亚基16S rRNA的A位点发生不可逆结合，抑制mRNA的转录和蛋白质的合成，从而抑制细菌的生长，在治疗病原微生物，尤其是需氧革兰阴性菌引起的感染中起着重要作用。然而，细菌可产生氨基糖苷类修饰酶，催化氨基糖苷类抗生素氨基或羟基的共价修饰，使得氨基糖苷类抗生素与核糖体的结合减少，促进药物摄取EDP-Ⅱ也被阻断，导致对氨基糖苷类抗生素耐药[2]。其中，由16S rRNA甲基化酶所介导的16S rRNA的甲基化，可导致细菌对氨基糖苷类抗生素产生高水平耐药。2009年，Savic等[17]利用MALDI-TOF MS对引起16S rRNA甲基化从而使细菌对氨基糖苷类抗生素耐药的甲基转移酶的活性进行了检测。有文献报道[18]，除了氨基糖苷类抗生素，酶的修饰作用还会导致细菌对氯霉素类以及青霉素类抗生素耐药。
现阶段使用的抗生素的作用靶点>50%位于细菌的细胞膜上，细胞膜上的蛋白，如微孔蛋白、外排泵等通过调节不同抗生素进出细胞从而决定细菌对抗生素的敏感性。敏感和耐药菌株中细胞膜上这些蛋白的表达存在差异，MALDI-TOF MS可以检测这一差异的存在从而将敏感和耐药菌株区别开来。Cai等[19]将MALDI-TOF MS成功用于克雷伯菌属细菌外膜蛋白OmpK36的检测。结果显示，6株外膜蛋白正常表达的菌株具有36 000 m/z和38 000 m/z的两个质谱峰(分别对应OmpK35和OmpK36)，而5株OmpK36缺失的菌株38 000 m/z的质谱峰缺失。Peng等[20]运用MALDI-TOF MS检测了氨苄西林、卡那霉素和四环素耐药铜绿假单胞菌的肌氨酸不溶性的外膜蛋白；Xu等[21]运用MALDI-TOF MS检测大肠埃希菌K-12的TolC、OmpC、YhiU等多种耐药相关外膜蛋白。
周质蛋白是存在于革兰阴性菌周质空间中的蛋白质，包括水解酶类、合成酶类、结合蛋白和受体蛋白等，周质蛋白在敏感和耐药菌株中的表达同样存在差异，MALDI-TOF MS同样可以检测出这一差异的存在从而将敏感和耐药菌株加以区分[22]。
MALDI-TOF MS除了能通过检测细胞膜和周质空间中的蛋白质表达差异区分敏感和耐药菌株外，还可以通过检测细菌脂多糖的结构改变而达到检测耐药菌株的目的。脂多糖是革兰阴性菌细胞壁的主要成分，对宿主有一定毒性，其毒性成分主要为类脂A。合成后修饰导致的类脂A负电荷丢失与阳离子抗菌肽如多粘菌素的耐药密切相关[23]，而在多粘菌素耐药的牙龈卟啉单胞菌[24]和黏菌素耐药的鲍曼不动杆菌[25]中也发现了类脂A的变化。除了类脂A的变化，与非还原糖结合的脂肪酸链的丢失也会导致脂多糖的结构发生改变，同时分子量发生相应的变化，而这一变化能够被MALDI-TOF MS检测到。
基于MALDI-TOF MS测序技术的基本原理：DNA扩增后，产物被纯化，使用等位基因特异性反应来获得可通过MALDI-TOF MS测量的DNA分子，对于等位基因特异性反应，微生物应用中最常用的技术是引物延伸法，而在该技术中，使用特异性的寡核苷酸，产物仅延伸几个碱基。根据产物分子量的变化，可以预测DNA的结构变化，如A>C会使相对分子量减少24×103，而A>G会使相对分子量增加24×103[26]。在该原理的基础上，可以运用MALDI-TOF MS检测阿莫西林耐药的幽门螺杆菌PBPs点突变[27]，检测肺炎链球菌中gyrA、gyrB、parC和parD等基因是否存在能够导致对喹诺酮耐药的突变[28]，检测penA和ponA基因突变以分析β-内酰胺类抗生素耐药的淋病奈瑟菌[29]以及检测单核苷酸多态性以鉴定SHV型[30]和TEM型[31]超广谱β-内酰胺酶。
目前，尽管已有较多基于MALDI-TOF MS的测序技术检测细菌耐药机制的相关研究，但是该方法工作量大且不能对DNA小片段进行检测，与传统的测序方法(基于PCR的SNP检测、DNA测序技术)相比，该技术没有优势可言[1]。
同位素标记法的理论基础是细胞生长要进行蛋白质合成。生长培养基中天然存在的某种氨基酸被其稳定同位素标记的形式替换，这些稳定同位素标记的氨基酸参与新的蛋白质的合成，导致新合成的蛋白质的质谱峰相对于原来的质谱峰发生偏移。在抗生素存在的情况下，耐药菌株仍然能够生长并且新合成被标记的蛋白质，这些蛋白质的质谱峰可以作为特征峰被MALDI-TOF MS检测；而在这种条件下，敏感菌株不会生长，从而无法检测到特征峰的存在。根据质谱峰的变化或者是否存在特征峰从而将敏感和耐药菌株加以区分。
同位素标记法已经成功应用于MRSA对苯唑西林和头孢西丁的敏感性检测[4]以及铜绿假单胞菌对环丙沙星、美罗培南和妥布霉素的敏感性检测[32]。理论上，稳定同位素标记法适用于所有抗生素敏感性检测，尤其是那些作用原理是抑制细菌蛋白质合成抗生素的检测。这种方法克服了水解法的缺点，除了可以检测产酶的耐药菌株，对于由其他机制引起的菌株耐药同样可以进行检测。但是，该方法价格昂贵且需要特殊的培养基——某种氨基酸缺乏而只存在其稳定同位素标记形式。此外，检测的质谱峰所代表的蛋白质的分子量必须预先已知，并且对于所有的菌株都是保守的。
内标法的理论基础是将待检细菌与待测抗生素共同孵育一定时间(该孵育时间是细菌和抗生素种类依赖性的)后，裂解细菌并加入内标(分子量大小已知且在质谱检测过程中稳定存在的蛋白质)后进行检测，细菌生长量的多少决定了细菌蛋白质谱峰强度与内标质谱峰强度的比值大小。在抗生素存在的情况下，不生长或生长缓慢(敏感)的细菌蛋白质谱峰强度弱，而正常生长(耐药)的细菌蛋白质谱峰强度强。比较在缺乏和存在相应抗生素时培养的相同细菌的生长速率(相对于内标)有助于评估测试的微生物对抗生素的敏感和/或耐药状态。Lange等[33]在该原理的基础上，将108株肺炎克雷伯菌与浓度8 μg/mL的美罗培南共同孵育1 h后进行检测，与E-test结果相比，该方法的敏感度和特异度分别为97.3%和93.5%。Sparbier等[34]同样以此原理为基础检测了大肠埃希菌对青霉素、头孢噻肟和环丙沙星的敏感性，铜绿假单胞菌对美罗培南和妥布霉素的敏感性以及肺炎克雷伯菌和鲍曼不动杆菌对妥布霉素的敏感性。
与同位素标记法一样，理论上，该方法适用于细菌所有抗生素敏感性检测。但是，该方法中所使用的内标的分子量必须提前已知，并且在检测过程中稳定存在(分子量不发生改变)，最重要的与检测的目标蛋白的分子量要有差异。
蛋白组学和基因组学研究表明，微孔蛋白、外排泵和脂多糖等多种细胞膜成分通过调节不同抗生素进出细胞从而决定细菌对抗生素的敏感性[35]。利用MALDI-TOF MS对耐药菌株进行蛋白组学研究可以建立耐药机制相关的主要蛋白指纹图谱，该方法已被证实可以用于野生型铜绿假单胞菌PAO1的周质蛋白[22]以及氨苄西林、卡那霉素和四环素耐药铜绿假单胞菌的肌氨酸不溶性的外膜蛋白[20]的快速检测。此外，该方法还可有效检测vanB阳性屎肠球菌[36]、万古霉素耐药肠球菌[37]、氨苄西林耐药具核梭杆菌[38]和氟康唑耐药假丝酵母菌[39]以及用于大肠埃希菌[40]、沙门氏菌[41]和结核分枝杆菌[42]敏感和耐药菌株间的比对。
蛋白质组学研究可用于构建细菌蛋白质指纹图谱的综合数据库，从而了解各种细胞成分在抗生素耐药中的作用。该研究提供有关基因表达的全部数据，而不仅仅只是关注单个基因。蛋白的表达通常取决于细菌的生长条件，因而确保细菌稳定的生长环境以及如何减少实验对人力的较大需求是该方法有待解决的问题。
综上可见，MALDI-TOF MS当前的研究主要集中在水解酶引起的抗生素的改变，基因突变和/或蛋白修饰引起的靶点的改变，蛋白组学研究多重耐药菌的耐药决定子。相信随着研究的不断深入，除了上述耐药机制的检测方法外，基于MALDI-TOF MS的新的耐药机制的检测方法将会逐渐被发现。除了用于耐药机制的检测，MALDI-TOF MS还可用于抗生素MIC的测定[43]，细菌[44,45,46]和病毒[47,48]的分型，细菌毒力检测[49]等。
拥有众多优点的MALDI-TOF MS也有其局限性，比如数据库数据有限，有些种属无法明确区分；培养环境差异，对实验重复性的影响；仪器昂贵，一次性投入成本高；技术门槛高，需要经过专业培训；检测方法商品化程度低，难以在常规实验室开展等。或许我们可以通过样品前处理的标准化、基质选择的规范化、数据库构建的完善化、开发实用的工具软件，以及与一些实验室常规方法相结合等方法提高检测的准确性和效率。MALDI-TOF MS在微生物相关领域中已崭露头角，随着研究的不断深入和广泛，相信这一革命性的方法必将发挥更大的作用。
利益冲突 无
