三维重建技术广泛应用于辅助医学诊断、手术模拟和解剖教学等领域。计算机断层扫描（CT）、磁共振成像（MRI）等传统影像学数据的分辨率并不能满足生命科学研究的需求。连续切片技术可提供绝大部分组织的精准高分辨率信息，对显微结构的研究和探索是一种非常有价值的方法。随着显微镜及图像处理技术的发展，小尺度连续切片的三维重建技术取得了重大发展，对样本形态和组织功能的分析成为可能，并且可对组织结构进行更完整的评估，在细胞和组织生物学领域引起了深刻的变革。就常见小尺度连续切片三维重建技术进行了比较和综述。
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显微形态学图像重建和评估技术已广泛应用于再生医学领域。高分辨率组织显微结构成像为三维图像重建与组织结构可视化提供了思路[1]。通过对生物样本的显微结构进行三维重建，研究者可以更好地对样本形态及功能进行测量与分析。连续组织切片三维重建技术是从19世纪末逐渐发展起来的一种最常见的显微结构三维重建技术，适于大多数生物组织的精准高分辨率模型的重建[2,3]。虽然连续组织切片的三维重建过程耗时且难以实现整体图像拼接，其重建过程还面临样本丢失、损坏、不均匀染色和变形的风险，但该方法对于显微结构的研究和探索仍然具有重要意义。其中，小尺度连续切片三维重建技术已随着显微成像技术的发展取得了重大进步，使得微米和纳米级结构的观测及形态描述成为可能，在细胞和组织生物学领域引起了深刻的变革。本文对典型小尺度连续切片三维重建技术进行了比较，并对其研究进展进行了综述。
1993年，Voie等发明了正交平面荧光光学切片（orthogonal-plane fluorescence optical sectioning，OPFOS）显微镜，其原理是使平面投射的激光穿过荧光染色的透明样本，并在与平面垂直的方向观测穿过样本的透射光，以获得图像信息[4]。该技术可通过旋转样本得到不同角度的连续二维图像信息，以用于三维重建。其优点在于可实现定量测量，采集过程短，可在微米级别（大于20 μm）的分辨率下显示骨组织和软骨组织[5]。此外，高分辨率OPFOS显微镜的出现使该技术的分辨率达到2 μm[6]。OPFOS技术最大缺点是样本制备过程繁琐，所需的脱钙、脱水、透明、匹配周围液体折射率、荧光染料着色等步骤会造成组织缩水，影响重建结果。例如，在对完整耳蜗进行重建的过程中，制备过程所致的内耳周围软组织缺失会导致其微观结构严重破坏，大大降低了重建模型的精确度[4]。此外，其测量准确性主要取决于样本的制备质量，样本中的暗区或高密度区、残留内含水或钙离子、激光折射或散射均会导致散焦和成像模糊，样本高密度区光吸收导致的激发光和荧光损失、残留色素、样本低透明度也会产生阴影，影响成像质量。
目前，OPFOS技术被认为是一种"无损"的三维重建技术，非常适合离体复杂结构的三维可视化，已应用于内耳、部分中耳、大脑形态学及小型无脊椎动物的研究[7]。
光学投影断层成像（optical projection tomography，OPT）是利用样本对可见光的吸收或发射来获得图像信息，并可使用多种有色光或组织荧光染色观察组织基因表达[8]。其样本通常放置于液体介质中，以减少光的散射和光通过样本时产生的折射率不均一。通过将样本以小于1°的角度进行旋转并采集每个角度的图像，OPT可得到一系列光学切片图像并用于三维重建。OPT技术的优点是能够达到几微米到几十微米的分辨率，可填补磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）和激光共聚焦显微镜（confocal laser scanning microscope，CLSM）之间的成像分辨率空缺，适用于0.5~10 mm样本的重建[9]。此外，OPT有利用组织特异性或基因特异性染料的能力，使计算机可以自动确定目标结构的轮廓，该特点对于特殊器官和组织的三维可视化尤为重要，但其难点在于控制染料用量及分布。
OPT技术特别适合脊椎动物胚胎重建和器官发生的三维解剖及生物医学样本中软组织、细胞、蛋白分布和基因表达的可视化研究，也适用于异常解剖、组织结构筛选、组织中标记细胞的定位等[10]。已有研究使用OPT分析胰岛细胞中β细胞的分布、脊椎动物的胚胎发育、免疫反应中戊肝病毒的生长，以及描绘小鼠心脏中分子介质的扩散[7,10,11]。
CLSM技术自Minsky[12]于1957年发明以来，历经数十年的发展，已广泛应用于生物医学领域。CLSM通过改变焦平面得到样本一系列不同深度的光学切片，通过计算机与图像处理软件挖掘上述数据中固有的三维信息，实现三维重建[13]，故CLSM也被称为切片断层成像技术。CLSM的分辨率可达0.5~1.0 μm[14]，可以和光学显微镜相媲美。CLSM的高分辨率、共焦成像、高灵敏度、光学切片及三维分析等特性可提供大量有价值的生物体信息，极大促进了基础研究及临床诊断研究的发展[13]。CLSM的缺点包括样本尺度受限、难以发现样本某些特殊荧光标记及样本标记物分布不均等。虽然理论上CLSM能对于厚度为0~300 μm的样本进行整体扫描，但由于组织情况、固定方式和荧光染料对信号的影响，通常其最大样本厚度不能超过100 μm[15]。
CLSM技术通常适用于无损伤的体内检测和定量分析，在组织形态学研究领域应用广泛，可用于分析细胞行为、神经末梢形态及功能、生物分子分布等[16,17,18]。例如，在微小无脊椎动物幼虫的肌红蛋白和神经发生通路等个体发育模式研究中，利用CLSM可实现50 μm至几毫米样本的精准三维重建[15]。
透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM）可对不同细胞类型亚显微结构进行分析，其成像原理为一个加速电子束穿过一系列磁性透镜（聚焦透镜、物镜、投影透镜），与样本相互作用产生图像投射至荧光屏或电子相机。通常TEM对多数类型细胞分析时需要进行化学固定、包埋和超薄切片，所获得图像会包括重叠区域的混合信息，导致图像质量的降低，而其三维模型的纵轴分辨率也受到切片厚度的影响和限制[19]。因此，利用TEM技术对连续切片进行三维重建的分辨率较低。此外，电子束的低渗透力和波前像差（增加样本厚度）限制其样本厚度为60~100 nm，极大程度地限制了样本体积的大小，使该技术通常应用于中等体积的样本。但随着中电压和高电压TEM的发展，其可用样本厚度提升了约50倍，达0.2~2 μm[20,21]。此外，立体像对的使用也使高电压TEM用于大体积样本三维结构可视化成为可能[22,23]。
目前，TEM技术已应用于有丝分裂分析、溶解性膜蛋白三维可视化及定量分析、神经元表面积测量等分子生物结构方面的研究[24,25,26]。
电子断层成像（electron tomography，ET）技术通过从样本获取一系列不同角度（±70°）的连续投影图像得到三维信息，其三维模型由连续的数字剖面组成，加之分辨率可达纳米级，故可得到高分辨率的图像信息[27,28,29,30]。因此ET被认为是一项高分辨率三维重建技术，解决了细胞及亚细胞水平结构的高分辨率三维分析问题。此外，随着近年来计算能力的提高和自动控制断层图像获取技术的进步，ET技术取得了巨大发展[31,32]，全自动技术替代传统的人工操作可大幅减少人工误差，软件自动功能也可纠正或最小化因图像采集过程中样本不断改变角度、图像采集角度不精准、样品台不稳定导致的样本移位和焦点改变。但是，ET技术仍然存在图像质量受样本质量影响大、图像分析过程耗时长等问题。
ET技术最适合细胞和细胞器这类多形性结构的三维重建[33]，已应用于核孔、病毒、微观、细菌超微结构、分子马达、细胞切片等生物分子的研究，近来还应用于单个蛋白结构的结构动力学研究[34]。
扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）技术是一种经典的样本表面特征描述技术，近年来该技术有了重大进步，逐渐被应用于三维重建领域。与TEM相似，SEM的图像来源于电子束和样本表面相互作用产生的一系列信号，当电子束扫描感兴趣区域时，探测器会收集每个扫描点的信号（表现为图像上相应像素的灰度值）并形成相应图像，其图像的信号强度取决于样本的表面状态，随着样本表面信号的采集，完成表面成像和样品分析[35]。对低能量电子更加敏感的新型探测器的使用，极大提升了SEM的图像质量。将SEM技术应用于三维重建，必须获得样本表面连续图像的数据信息。因此，新型连续图像采集策略应运而生，产生了一系列基于连续图像采集SEM的三维重建技术。
连续切片扫描电子显微镜（serial-section scanning electron microscopy，ssSEM）使用硅片作为切片条带（ribbon）的承载物，直接连接样本和显微镜载物台，既方便样本处理，又可减少图像获得过程中对切片的处理步骤，从而减少数据采集过程中的错误。此外，切片紧贴附于硅片，避免了切片自身折叠对测量区域和图像质量的影响。从ssSEM技术衍生出的自动条带收集超薄切片法（automated tape-collection ultramicrotomy）可增加每个样本的切片数量[36]，使大体积组织和细胞的数据获取成为可能。与传统TEM相比，SEM视野更大、图像采集过程耗时更短，且整个切片可在不受栅格干扰的情况下进行扫描，但其图像的横向分辨率低于TEM。
ssSEM主要应用于神经突触等细胞及亚细胞结构的三维重建。Horstmann等[37]采集了100张脑干花萼突触（calyx of Held）的连续切片，并成功构建了分辨率为3.7 nm×3.7 nm×35 nm的三维模型。
连续样本表面-扫描电子显微镜（serial block-face scanning electron microscopy，SB-SEM）可以获得大面积和大体积样本的三维信息，SEM样品室内的超薄切片机对样本进行切片，然后按照样本表面暴露的先后顺序对其进行扫描。该方法得到连续图像的过程简单，而且对样本体积没有限制，可实现mm3级尺度的样本图像采集[38]。该方法的另一个优点是可以连续工作，其原始图像直接输出到软件得到的图像序列可直接用于对齐、分割、重建和量化，大大缩短了人工采集切片的时间。但是，SB-SEM的纵轴分辨率受到切片厚度和电压的限制[39]，通常低于聚焦离子束-扫描电子显微镜（focused ion beam scanning electron microscopy，FIB-SEM)，其横向分辨率取决于图像设置，且也受到电压的影响。
SB-SEM技术已广泛应用于生物学、材料学等领域[40]，其中最重要的方向是对于大脑神经网络的重建及分析，可应用于各类神经网络研究中[41,42,43]。Wilke等[44]利用SB-SEM对大脑内最复杂的突触结构之一——海马苔藓纤维末梢进行了研究，获得了12 500 μm3的样本信息，证实了SB-SEM技术应用于大体积组织的可行性。此外，SB-SEM与光学显微镜或细胞电子断层显微镜（whole-cell electron tomography）的结合在内质网等细胞器结构研究方面有独到优势[45]。
FIB-SEM的原理与SB-SEM相似，也可以获得大体积样本的信息，且图像的纵轴分辨率较高，但其横向分辨率较低（低于其他扫描电子显微镜技术）、相互作用区域的影响、反射电子信号的可探测深度限制了FIB-SEM的图像分辨率。此外，其图像分割和建模过程中的渲染步骤非常耗时，且聚焦离子束的视野限制了其处理范围。尽管如此，通过与聚焦离子束铣削和二次电子成像技术的结合，以及快速冰冻和冻结置换技术的使用，已经实现了脂质双分子层级别分辨率的图像采集[46]。近期研究表明，聚焦离子束削铣不仅可以在处于低温环境下的微型机器中操作，并且可在冷冻水合条件下加工出没有微小裂隙、没有压缩效果的超薄切片[47]。
FIB-SEM技术多应用于生物学研究，并由制备透射电镜样本[48]发展至三维重建领域，可在10 nm的空间分辨率下对哺乳动物和非哺乳动物的细胞及组织结构进行重建[49]。
OPFOS技术是CLSM技术的一种，可在微米水平显示骨组织和软组织结构，并且可提供传统组织切片的细节信息。其最大优势是可自动获取并对齐光学切片，但由于样本制备过程对微结构的破坏，导致其应用范围有限，最适于哺乳动物完整耳蜗的分析。OPT和CLSM均可用于在体研究，且可进行荧光成像；其难点在于荧光染料用量及分布的控制；OPT分辨率较低，但可用于大体积生物样本（厚度1~10 mm）的研究；CLSM分辨率虽优于OPT，但其样本厚度限制在100 μm，多用于细胞、神经末梢等样本的研究。TEM连续切片三维重建方法的缺点是费时费力，且由于受到单个栅格切片数量的限制，通常只能得到微米尺度样本的信息。ET技术可实现非常高的分辨率，但其对大体积或厚样本进行成像时通常要求使用中电压或高电压电子显微镜。SB-SEM和FIB-SEM，可在TEM分辨率尺度下对大体积样本进行快速三维重建，因此应用前景广阔。
三维重建技术的发展将有助于研究人员开发出高仿真度的组织工程支架材料。虽然"高仿真度"很难界定，但是组织工程支架材料的结构和组成必须可以模拟正常组织，二者之间的相似性越高，修复和替代的效果就越好。在三维重建技术的帮助下，解剖学家可以获得人体器官的组织学信息并且展示其解剖结构，而材料科学家可以利用这些数据生产出精准的模型，从而提高生物工程组织材料的制造水准。
三维打印是指利用增材工艺将材料以不同形状叠加到连续层面上，从而将三维数字信息加工为三维实体的过程。该技术出现于20世纪80年代，但直到21世纪才广泛应用于商业化用途。三维打印所使用的数字模型可以通过Amira和Mimics等三维重建软件构建。三维重建和三维打印在仿生材料的制作上有着至关重要的作用。三维打印机是将打印材料一层一层进行堆叠的，这就允许目标器官三维模型的构建可以基于一系列连续切片；并且三维模型可以直接导入打印控制系统，有效避免了转换和重新编码可能造成的低准确度和变形。因此，三维重建和三维打印技术的结合可实现按照组织和器官原有的组装方式进行重建，这一特点使其在组织工程支架制造方面具有独到优势。此外，组织工程支架制作完成之后，干细胞种植过程十分困难，传统干细胞种植方法仅能使细胞分布在支架表面。三维打印技术可使支架材料和干细胞通过多喷头的方式同时进行打印，使干细胞均匀分布于支架，从而解决上述问题。
随着三维重建及三维打印技术的发展，人体复杂器官的三维打印将成为快速简便的组织器官修复方法，极大促进了医疗技术的发展，开启生物医学领域的新时代。
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