探讨成人急性B淋巴细胞白血病（B-ALL）患者的基因突变谱，并分析其对患者预后的影响。
收集113例2009年6月至2015年9月收治的成人B-ALL患者DNA标本，采用靶向特异的二代测序技术，针对血液恶性疾病相关的112种基因进行突变分析，通过多个数据库筛选出可能致病的基因突变，描述其发生频谱，并通过Kaplan-Meier、Cox回归模型分析突变基因对患者总生存（OS）和无复发生存（RFS）的影响。
113例患者中103例（92.0%）发生至少一种基因突变，29例（25.6%）患者发生≥3种基因突变。所有患者中突变率较高的基因有SF1、FAT1、MPL、PTPN11、NRAS等，Ph阳性B-ALL和Ph阴性B-ALL患者中基因突变特点不尽一致。进一步分析基因突变对患者预后的影响，发现在Ph阴性B-ALL中伴JAK-STAT信号通路相关基因突变的患者（如JAK1、JAK2突变）较该信号通路未受影响的患者预后差（OS：P值分别为0.011和0.001；RFS：P值分别为0.014和<0.001），而伴PTPN11突变的B-ALL患者较不伴PTPN11突变的患者有较好的OS及RFS，但差异无统计学意义（P值均>0.05）；在Ph阳性B-ALL患者中，表观遗传学修饰相关的信号通路异常的患者预后较差（OS：P=0.038；RFS：P=0.047）。
基因突变在成人B-ALL中存在普遍性，发生频谱因亚型而异，涉及多种信号通路，JAK家族相关基因突变常提示患者预后较差，突变基因之间的共存现象也预示着成人B-ALL患者的遗传复杂性和不稳定性。
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急性淋巴细胞白血病（ALL）是一种由原始淋巴细胞在造血和淋巴组织（特别是骨髓、脾脏和淋巴结）无限增殖所致的恶性血液病，是儿童最常见的白血病类型，占成人急性白血病的15%~25%[1]。成人ALL生物学特征多样，临床异质性大，治疗效果较差。随着遗传学及分子生物学的发展，WHO2008白血病淋巴瘤分类标准将ALL归入前体淋巴细胞肿瘤并且进行了新的以遗传学（包括细胞遗传学和分子遗传学）为基础的分类,在WHO2016标准中这一趋势更加明显。60%以上的ALL患者存在细胞遗传学异常，更多的患者可测出分子遗传学异常，这些分子遗传学异常对疾病的发生、治疗及预后均具有重要意义[2]。近年来随着二代测序技术的应用，基因组学研究已在儿童ALL中广泛开展，在成人ALL中也日益受到重视，主要包括全基因组/外显子组/转录组测序分析、基于基因芯片技术的基因组多态性分析以及表观遗传学研究等。这些技术的应用对于确定体细胞突变、表观遗传学修饰等具有重要意义[3]。我们收集于中国医学科学院血液病医院就诊的113例成人B-ALL患者的标本和临床资料，应用Ion Ampliseq二代测序方法靶向检测血液恶性疾病相关的112种基因，分析高频的基因突变与患者预后的关系。
2009年6月至2015年9月在我院就诊的113例B-ALL患者纳入研究，其中男70例，女43例，中位年龄30（14~61）岁。采用MICM（形态学、免疫学、细胞遗传学和分子生物学）诊断模式，分型采用WHO2008标准，同时参考欧洲白血病免疫学分型协作组（EGIL）诊断标准。其中包括伴t（9；22）/BCR- ABL异常（Ph阳性）的患者46例（40%），Ph阴性患者67例（60%）。初诊时外周血中位WBC 36.90（0.59~539.06）×109/L。纳入本研究的患者均签署知情同意书。
113例患者中，5例患者未在我院治疗，治疗情况不详。其余均采用CALLG2008方案[4]治疗,诱导治疗根据有无BCR-ABL融合基因分为VDCP+酪氨酸激酶抑制剂（TKI）和VDCLP方案。
取患者骨髓或外周血，分离单个核细胞，提取DNA，采用靶向特异的二代测序技术（超高多重PCR捕获，超深高通量平行测序），利用Ion Torrent半导体平台检测预先设计的血液恶性疾病相关的基因面板（覆盖112种基因的完整编码区或点突变），结果映射到NCBIhg19RefSeq，平均覆盖率>97%，平均深度800x，排除在dbSNP135中注释的基因多态性，所有检测出的基因（外显子区）通过千人基因组计划、COSMIC（癌症中的体细胞突变目录）及PolyPhen-2（Polymorphism Phenotyping 2）数据库进行筛选。
采用电话联系方式随访，随访截至2017年6月1日。中位随访时间为25.9（5.6~87.0）个月，失访11例，失访率9.7%（11/113）。总生存（OS）期指自诊断到死亡或末次随访日期。无复发生存（RFS）期指自治疗后第1次完全缓解（CR）到第1次复发或缓解期死亡或末次随访日期。
所有统计学处理均采用SPSS23.0软件完成。计量资料如符合正态分布，结果用均值±标准差表示，组间比较采用t检验；计数资料采用卡方检验，生存曲线采用Kaplan-Meier分析，多因素分析采用Cox回归分析，P<0.05为差异有统计学意义。
113例患者中有104例（92.0%）患者发生至少1种基因突变，中位突变数为2（0~7）种，29例（25.6%）患者有≥3种基因突变。我们通过上述介绍的数据库筛选出56种可能致病的突变基因，突变率排在前五位的依次为SF1、FAT1、MPL、PTPN11、NRAS（均>6%），其后依次为TP53、KRAS、JAK2、DIS3、EZH2、KMT2D、SF3B1、CREBBP（均>4%）。分别分析Ph阳性组和阴性组患者基因突变率，Ph阳性B-ALL患者中突变率较高的基因有FAT1、SF1、EP300、MPL、CREBBP、UNC13D、NF1；而Ph阴性B-ALL患者中突变率较高的基因有SF1、PTPN11、FAT1、NRAS、MPL、TP53、JAK2、DIS3、EZH2及JAK1。PTPN11、JAK1/JAK2突变主要发生于Ph阴性B-ALL患者中。共有6例患者发生TP53突变，其中5例为Ph阴性B-ALL（图1）。图2展示了突变基因之间的共存关系，广泛的共突变现象表明成人B-ALL患者中的遗传复杂性和不稳定性。
在所有B-ALL患者中，SF1基因突变率最高，达10.62%（12例），突变位点包括p.M449V、p.M475V、p.M600V、p.Y476C、p.T474A、p.Y476C、p.A1574T、p.T2321M、p.G2480S。其余突变率较高的基因及相应突变位点详见表1。
成人急性B淋巴细胞白血病患者突变基因及相应的氨基酸改变位点
成人急性B淋巴细胞白血病患者突变基因及相应的氨基酸改变位点
| 突变基因 | 氨基酸改变位点 |
|---|---|
| FAT1 | p.R1257Q、p.V3694I、p.A4551G、p.T1679I、p.T1492S、p.E1141D、p.D1113N |
| SF1 | p.M449V、p.M475V、p.M600V、p.Y476C、p.T474A、p.Y476C、p.A1574T、p.T2321M、p.G2480S |
| NRAS | p.G12D、p.G12A、p.G12S、p.Q61K、p.G12V、p.G12D、p.G12C |
| CREBBP | p.L513I、p.L551I、p.A254T |
| PTPN11 | p.D61Y、p.P491S、p.S502T、p.E76G、p.A72D、p.K308D、p.T73I |
| JAK2 | p.R683G、p.D873N、p.R683S、p.P933Q、p.T875N、p.V617F |
| DIS3 | p.S557、p.S587F |
| MPL | p.R321Q |
| KMT2D | p.R3714K、p.V401M、p.M3349V、p.R2401H |
| EP300 | p.S507G |
| RUNX1 | p.I114I、p.I87I、p.R177X、p.R204X、p.R135K、p.R162K、p.R293X、p.R320X |
| TP53 | p.R116W、p.R209W、p.R248W、p.R89W、p.S109F、p.S202F、p.S241F、p.S82F、p.R123P、p.R150P、p.R243P、p.R282P、p.R124L、p.R151L、p.R244L、p.R283L、p.I112V、p.Y220C、p.A144V |
| EZH2 | p.R628C、p.R640C、p.R670C、p.R679C、p.R684C、p.D146H、p.D674-Y675delinsX、p.D730-Y731delinsX |
| KRAS | p.G60D、p.G13D、p.A146T、p.A18D、p.G12D |
| SF3B1 | p.R625C、p.G740R、p.K700E、p.D907Y、p.L747W |
| JAK1 | p.S703I、p.Y652H、p.A701V、p.S646F |
| CSF3R | p.P733T、p.P760T |
| UNC13D | p.G863D |
二代测序芯片涵盖的基因主要涉及Ras/蛋白磷酸酶/有丝分裂原活化蛋白激酶通路（Ras/Protein phosphatase/MARK）、转录因子/调控（Transcription factor/regulation）、表观遗传学修饰、剪接与mRNA加工调控（Splicing and mRNA processing regulation）、JAK-STAT等信号通路[5,6,7]，各信号通路涉及的突变基因和发生频率见表2。27.43%的B-ALL患者Ras/Protein phosphatase/MARK信号通路基因发生突变，包括NRAS、KRAS、NF1、PTPN11、CBL1及TP53基因，主要发生在Ph阴性B-ALL患者中，占35.82%（24/67）。
受影响的信号通路涉及的突变基因及发生率
受影响的信号通路涉及的突变基因及发生率
| 信号通路 | 基因 | 发生率(%) |
|---|---|---|
| Ras/蛋白磷酸酶/MARK/PI3K | NRAS、KRAS、PTPN11、NF1、CBL、TP53 | 27.43 |
| 转录因子/调控 | CREBBP、RUNX1、EP300 DNM2、CEBPA、PHF6、WT1、PRDM1、GATA3、UNC13D、ITK | 25.66 |
| 表现遗传学修饰 | TNFAIP3、CYLD、TET2、DNMT3A、IDH1、SETBP1、ASXL1、KMT2D、EZH2、WHSC1 | 23.01 |
| 剪接与mRNA加工调控 | SF1、U2AF1、DIS3、SF3A1、SF3B1 | 22.12 |
| 酪氨酸激酶受体/非受体 | FGFR3、PDGFRB、FLT3、ABL1、CSF3R | 15.04 |
| JAK-STAT | JAK1、JAK2、JAK3、CRLF2 | 11.50 |
| WNT | FAT1 | 10.62 |
| NOTCH | NOTCH2、NOTCH1、FBXW7 | 2.65 |
| 其他 | MUM1、NPM1、CUX1、ECT2L、STXBP2、MPL、ARID1A | 15.04 |
11.50%的B-ALL患者JAK-STAT信号通路异常，涉及的突变基因有JAK1、JAK2、JAK3及CRLF2，主要发生在Ph阴性B-ALL患者中[Ph阳性B-ALL：6.52%（3/46）；Ph阴性B-ALL：14.93%（10/67）]。而JAK基因高频突变预示较多的患者会伴有CRLF2重排[8]。这一信号通路异常也提示Ph样ALL的可能[9]。
表观遗传学修饰相关的基因突变率达23.01%，具体包括DNA甲基化（TET2、DNMT3A、IDH1）、组蛋白修饰（SETBP1、ASXL1、EZH2、WHSC1）、泛素化途径（CYLD）。近年比较重视的剪接与mRNA加工调控相关的基因突变，也有较高的发生率。
全组患者中位OS时间为26.28（5.59~87.00）个月，中位RFS时间为23.31（0~86.00）个月。我们分析了发生频率较高的基因突变对患者OS及RFS的影响。单因素分析结果显示：在成人B-ALL中，伴PTPN11突变的患者较不伴有PTPN11突变的患者有较好的预后，但差异无统计学意义（OS：P=0.072；RFS：P=0.068）；FAT1和SF1基因突变率最高，均达10.62%，但未发现对预后有明显的影响（P值均>0.05）。在Ph阳性和阴性组中分析基因突变对预后的影响，发现在Ph阴性B-ALL中，伴有JAK1或JAK2突变的患者预后较不伴突变者差，差异有统计学意义（OS：P=0.011，RFS：P=0.014；OS：P=0.001，RFS：P<0.001）（图3、图4）。PTPN11基因突变率为6.19%（7/67），伴有该突变的患者较不伴该突变者有较好的OS及RFS，但差异无统计学意义（P值均>0.05）。
进一步分析各信号通路相关基因突变对预后的影响。在Ph阴性B-ALL中，JAK-STAT信号通路异常患者（7/61）与无异常者比较有较差的OS（P=0.002）及RFS（P=0.003）（图5A、图5B）。Ras/Protein phosphatase/MARK信号通路相关基因（NRAS、KRAS、NF1、PTPN11、CBL、TP53、AKT1）总的突变率为27.43%，该通路相关基因突变患者与未突变患者的预后差异无统计学意义（P值均>0.05）。另外我们发现，在Ph阳性B-ALL患者中，表观遗传学修饰相关的信号通路异常患者（5/41）预后较无异常者差（OS：P=0.038；RFS：P=0.047）（图6A、图6B）。
多因素分析结果显示，WBC（OS：P=0.021，HR=2.113，95%CI 1.120~3.989；RFS：P=0.037，HR=1.963，95%CI 1.043~3.697）在成人B-ALL中有独立预后意义。在Ph阴性B-ALL中，JAK2突变（OS：P<0.001，HR=9.469，95%CI 2.673~33.551；RFS：P<0.001，HR=11.809，95%CI 3.354~41.575）、WBC（OS：P=0.044，HR=2.709，95%CI 1.029~7.128；RFS：P=0.046，HR=2.608，95%CI 1.017~6.687）有独立预后意义。
ALL是一种常见的血液系统恶性肿瘤，随着二代测序技术的应用，对ALL的遗传学改变有了比较深入的了解，陆续发现了一系列与疾病诊断、危险度分层、治疗相关的分子标志，如IKZF1、FLT3/ITD、NOTCH1、FBXW7、CREBBP、PHF6、CDKN2A、CDKN2B、CRKL、BAK1、PAX5等基因突变，CRLF2、JAK2重排等。正是基于这些发现，提出了Ph样ALL、ETP-ALL等疾病类型，WHO2016分类将这些疾病类型定为建议分类。
采用外显子捕获测序技术，利用Ion Torrent半导体平台检测预先设计的血液恶性疾病相关的112种基因，此种检测方法对点突变的检测效果好，对于短的插入缺失（<8 bp）的异常亦能检测，但对长片段的插入缺失突变检测效果差。在此面板中，常以插入缺失突变为主的基因如IKZF1、CEBPA、NPM1、CALR、FLT3-ITD，以及以重排变异为主的基因如CRLF2、PDGFRB等，检测效果均不理想。所有检测出的基因通过多个数据库进行筛选，进一步分析可能致病的突变基因，这些基因涉及Ras/Protein phosphatase/MARK通路、转录因子/调控、表观遗传学修饰、剪接与mRNA加工调控、JAK-STAT等多个信号通路。共分析113例患者，其中103例（92.0%）患者发生至少1种基因突变，29例患者有≥3种基因突变；突变率较高的基因有SF1、FAT1、MPL、PTPN11、NRAS等。Ph阳性ALL和Ph阴性ALL中基因突变特点不尽一致，Ph阳性B-ALL中突变率较高的基因有FAT1、SF1、EP300、MPL、CREBBP、UNC13D、NF1；而Ph阴性B-ALL中突变率较高的基因有SF1、PTPN11、FAT1、NRAS、MPL、TP53、JAK2、DIS3、EZH2及JAK1。PTPN11、JAK1/JAK2突变主要发生于Ph阴性B-ALL中。
JAK-STAT信号通路一直是研究的热点，该信号通路由JAK家族（JAK1、JAK2、JAK3和酪氨酸激酶2）和STAT家族（STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b和STAT 6）组成[10,11]。有研究者报道在成人B-ALL中JAK1突变率为3.4%[12]，在儿童高危组ALL及唐氏综合征相关的ALL中JAK2突变率分别为10%、20%[13,14,15,16]。本研究中我们采用特异的二代测序技术分析，结果显示，在成人B-ALL中JAK1、JAK2突变率分别为3.54%、4.42%；在Ph阴性B-ALL中分别为5.97%、7.46%。数据显示，在Ph阴性B-ALL中，JAK-STAT信号通路基因突变（如JAK1或JAK2突变）的患者预后较差；JAK2突变在Ph阴性B-ALL中有独立预后意义，与文献报道一致。
PTPN11基因位于染色体12q24.1，编码protein tyrosine phosphatase SHP-2[17]，它的突变可能通过异常的Ras/MAPK激酶途径介导血液肿瘤的发生、发展[18]。既往文献报道，317例儿童B-ALL中有23例发生PTPN11突变，突变率为7.3%。Barbosa等[19]分析了134例儿童B-ALL患者中PTPN11基因突变对预后的影响，发现PTPN11基因突变并不改变儿童B-ALL的OS率。本组存在PTPN11突变的患者有较好的预后，但差异无统计学意义，与既往报道趋势相同[20]。
总之，我们的研究结果提示基因突变在成人B-ALL中存在普遍性，发生频谱因ALL的类型而异，涉及多种信号通路，JAK家族突变常提示患者预后较差，突变基因之间共存现象明显。
