了解北京地区儿童金黄色葡萄球菌皮肤软组织感染(skin and soft tissue infections，SSTIs)临床分离株的分子学分型、相关毒力基因携带和耐药情况。
收集2016年1月至12月首都医科大学附属北京儿童医院金黄色葡萄球菌SSTIs病例52例，并进行临床资料采集分析。采用头孢西丁纸片法和mecA基因检测鉴定耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin－resistant Staphylococcus aureus，MRSA)或甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(methicillin－susceptible Staphylococcus aureus，MSSA)；对所有菌株进行多位点序列分型(multilocus sequence typing，MLST)及葡萄球菌A蛋白(spa)序列分型，并对MRSA菌株进行葡萄球菌盒氏染色体(staphylococcal cassette chromosome mec，SCCmec)分型；采用PCR方法检测pvl、eta、etb、tsst-1及hlg基因；采用琼脂倍比稀释法检测菌株对16种抗生素药物敏感性。
52例金黄色葡萄球菌SSTIs患儿中(其中MRSA SSTIs患儿30例，MSSA 22例)，0～1岁23例(44.2%)，最常见的疾病为新生儿脐炎12例(12/52株，23.1%)，其次为皮肤及软组织脓肿11例(11/52株，21.2%)。MRSA分离株的流行克隆是ST59-MRSA-SCCmecⅣa-t437(14/30株，46.7%)，MSSA分离株并未发现明显的流行克隆。共检测出10种序列型(ST型别)，以ST22为主(6/22株，27.3%)；14种spa型别，其中t309型5株(5/22株，22.7%)。MRSA及MSSA分离株多重耐药率均>85%。对红霉素、青霉素、氯霉素及克林霉素的耐药率分别为100.0%、94.2%、69.2%、63.5%，但均对复方磺胺甲
唑、莫匹罗星、夫西地酸、替加环素、利奈唑胺及万古霉素敏感。pvl基因阳性率为40.4%，MRSA和MSSA分离株pvl基因的携带率差异无统计学意义(P>0.05)。2例葡萄球菌性烫伤样皮肤综合征患儿的临床分离株中均检测到eta及etb基因。
北京地区儿童金黄色葡萄球菌SSTIs临床分离株多见于新生儿脐炎及脓肿，多重耐药率高，经验性治疗不宜首选红霉素和克林霉素。ST59-MRSA-SCCmecⅣa-t437是MRSA分离株最常见流行克隆，而MSSA分离株的遗传背景更多样化。
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皮肤软组织感染(skin and soft tissue infections，SSTIs)是儿童常见疾病之一，其病情变化程度大，可以是轻度浅表局限性感染，如毛囊炎；也可以是威胁生命的坏死性软组织感染，如坏死性筋膜炎。金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是引起儿童SSTIs最常见的病原菌，特别是20世纪60年代耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin－resistant Staphylococcus aureus，MRSA)出现以来，在美国、中国台湾等地金黄色葡萄球菌所致SSTIs均呈逐年升高的趋势[1,2]。为了解北京地区儿童金黄色葡萄球菌SSTIs临床分离株的分子特征，本研究对2016年1月至12月首都医科大学附属北京儿童医院收集的金黄色葡萄球菌SSTIs临床分离株进行分子学分型、相关毒力基因携带和抗生素耐药性分析，为预防和治疗金黄色葡萄球菌SSTIs感染提供理论依据。
对2016年1月至12月首都医科大学附属北京儿童医院门诊及病房收集的52例临床及实验室诊断为金黄色葡萄球菌SSTIs病例进行临床资料采集分析，对分离株进行分子生物学、毒力基因及耐药性研究。同一病例检测出的相同菌株作为1株。通过菌落形态学、凝固酶试验和PCR法检测nuc基因进行金黄色葡萄球菌鉴定。采用头孢西丁纸片(英国Oxoid公司)法及PCR方法检测mecA基因进行MRSA菌株的筛选。以金黄色葡萄球菌标准株ATCC25923作为对照质控菌株。本研究通过首都医科大学附属北京儿童医院医学伦理委员会的批准(批准文号2016-93)。
溶葡萄球菌素(加拿大BBI公司)，1 200 U/mg；硅胶模型TM基因组DNA提取试剂盒(北京赛百盛公司)，严格按照试剂盒说明书操作。所提DNA作为所有PCR的模板。
使用PCR扩增金黄色葡萄球菌的7个管家基因：arcC、aroE、glpF、gmk、pta、tpi和yqil。扩增引物参考Enright等[3]的设计，目的片段由北京天一辉远生物技术有限责任公司进行测序。在MLST数据网站(http：//www.mlst.net/)进行比对，首先确定每个位点的等位基因编号，然后将该菌株的等位基因编号按照指定的顺序排列得到等位基因谱，即序列型(sequence type，ST)，从而判定本株菌的ST类型。
采用Milheiriço等[4,5]提出的多重PCR的方法对MRSA分离株进行SCCmec分型及亚型检测。PCR产物在含溴化乙啶的15 g/L琼脂凝胶中电泳，用凝胶成像仪观察和保存扩增结果。SCCmec分型的标准菌株由日本顺天堂大学Teruyo Ito教授馈赠。
扩增的目的片段测序结果通过spa分型数据库(http：//spaserver.ridom.de/)进行分型。spa分型的PCR扩增引物：上游引物：5′-GACGATCCTTCAGTGAGCAAAG-3′；下游引物：5′-GCAGCAATTTTGTCAGCAGTAG-3′。
采用PCR方法检测毒力基因pvl、eta、etb、tsst-1、hlg，引物分别参照Jarraud等[6]、Holtfreter等[7]及Lina等[8]的设计。PCR产物在含溴乙啶的15 g/L琼脂凝胶中电泳，用凝胶成像仪观察和保存扩增结果。
根据2017年美国临床实验室标准化研究所制定的标准[9]，采用琼脂倍比稀释法检测菌株对青霉素(PEN)、苯唑西林(OXA)、头孢呋辛(CXM)、红霉素(ERY)、克林霉素(CLI)、庆大霉素(GEN)、复方磺胺甲
唑(SXT)、环丙沙星(CIP)、氯霉素(CHL)、四环素(TCY)、利福平(RIF)、万古霉素(VAN)、利奈唑胺(LNZ)、夫西地酸(FUS)、莫匹罗星(MUP)、替加环素(TGE)的敏感性，抗生素标准品购自中国药品生物制品鉴定所，以金黄色葡萄球菌ATCC29213作为对照质控菌株。其中FUS和TGE根据2017年欧洲抗生素敏感性委员会(EUCAST，version7.1，2017)的规定界定敏感性(TGE≤0.5 mg/L为敏感，>0.5 mg/L为耐药，FUS≤1 mg/L为敏感，>1 mg/L为耐药)[10]。同时对3类或3类以上抗生素耐药的金黄色葡萄球菌菌株为多重耐药菌株[11]。
使用SPSS 19.0软件进行统计分析。计数资料用例数或菌株数表示，组间比较采用χ2检验或Fisher′s确切概率法。P<0.05为差异有统计学意义。
52例SSTI患儿中，男26例(50.0%)，女26例(50.0%)；28例(53.8%)来自城市，24例(46.2%)来自农村；年龄0～15岁，其中0～1岁23例(44.2%)，>1～3岁10例(19.2%)，>3～6岁9例(17.3%)，>6～12岁8例(15.4%)，>12～15岁2例(3.8%)。最常见的疾病为新生儿脐炎12例(23.1%)，其次为脓肿11例(21.2%)，表浅皮肤感染7例(13.5%)，颈淋巴结炎5例(9.6%)，术后伤口处皮肤感染4例(7.7%)，蜂窝织炎3例(5.8%)，葡萄球菌性烫伤样皮肤综合征2例(3.8%)，烧伤、烫伤及骨折后皮肤感染各1例(各占1.9%)，中毒样表皮坏死松解症、甲沟炎、脓疱疮、左足趾感染及坏死性筋膜炎各1例(各占1.9%)。52株金黄色葡萄球菌临床分离株中，30株为MRSA，22株为甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA)；MRSA和MSSA分离株在患儿性别、居住地、不同年龄组及病种方面的差异均无统计学意义(均P>0.05)。
30株MRSA分离株中，共检测出9种ST分型，ST59是最主要的分型(22株，73.3%)，ST1、ST30、ST88、ST121、ST338、ST896、ST1224、ST1821各1株(各占3.3%)。SCCmec分型共检测出3种型别，主要为Ⅳa型(24/30株，80.0%)，其次为Ⅴ型(4/30株，13.3%)，Ⅳg型1株(3.3%)，1株无法分型。共检测出10种spa型别，以t437为主(18/30株，60.0%)，其次为t441(3/30株，10%)，t012、t114、t172、t309、t3515、t3590、t4549及t8660各1株(各占3.3%)，1株spa无法分型。MRSA SSTIs临床分离株的流行克隆是ST59-MRSA-SCCmecⅣa-t437，共14株，占46.7%。
22株MSSA分离株中，共检出10种ST分型，以ST22为主(6/22株，27.3%)，其次为ST15、ST25各3株(各占13.6%)，ST59、ST121、ST188各2株(各占9.1%)，ST5、ST6、ST95、ST398各1株(各占4.5%)。ST59型在MRSA及MSSA分离株中均存在。spa分型共14种，其中t309型5株(22.7%)，t078、t189型各2株(各占9.1%)，t084、t163、t2092、t279、t310、t346、t437、t571、t701、t7065、t954各1株(各占4.5%)，2株spa无法分型。MSSA临床分离株并未发现明显的流行克隆。
抗生素敏感性测定结果见表1。所有菌株对SXT、MUP、FUS、TGE、LNZ及VAN敏感，此外MSSA分离株还对OXA、CXM及RIF敏感。所有菌株对ERY耐药率为100.0%，其次为PEN、CHL及CLI，耐药率分别为94.2%、69.2%、63.5%。MRSA及MSSA分离株多重耐药率均>85%。最常见的耐药表型为ERY-CHL-PEN及ERY-CLI-CHL-PEN，各7株(7/52株，各占13.5%)，其次为OXA-ERY-CLI-CHL-CMX-PEN-TCY，5株(5/52株，9.6%)。除OXA及CXM外，MRSA对CLI及TCY的耐药率高于MSSA，且差异有统计学意义(P<0.05)。MRSA有2株分离株同时对8种抗生素耐药，且均属于ST59克隆。
儿童金黄色葡萄球菌SSTIs临床分离株抗生素敏感性结果
Results of the antimicrobial non－susceptibility of Staphylococcus aureus strains isolated from children with SSTIs
儿童金黄色葡萄球菌SSTIs临床分离株抗生素敏感性结果
Results of the antimicrobial non－susceptibility of Staphylococcus aureus strains isolated from children with SSTIs
| 抗生素 | 总数(52株) | MRSA耐药率(%)(30株) | MSSA耐药率(%)(22株) | χ2值 | P值 | ||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| MIC50(mg/L) | MIC范围(mg/L) | 耐药率(%) | |||||
| 青霉素 | 8.000 | 0.023～64.000 | 94.2 | 96.7 | 90.9 | 0.774 | 0.379 0 |
| 苯唑西林 | 2.000 | 0.125～64.000 | 40.4 | 70.0 | 0 | 25.832 | <0.000 1 |
| 头孢呋辛 | 2.000 | 0.190～>256.000 | 21.2 | 36.7 | 0 | 10.231 | 0.001 4 |
| 红霉素 | >256.000 | 0.750～>256.000 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | － | － |
| 克林霉素 | >256.000 | 0.125～>256.000 | 63.5 | 80.0 | 40.9 | 8.364 | 0.003 8 |
| 庆大霉素 | 1.500 | 0.750～64.000 | 9.6 | 3.3 | 18.2 | 3.220 | 0.072 7 |
复方磺胺甲 唑 | 0.047 | 0.016～1.500 | 0 | 0 | 0 | － | － |
| 环丙沙星 | 0.500 | 0.250～>32.000 | 19.2 | 16.7 | 22.7 | 0.300 | 0.583 8 |
| 氯霉素 | 12.000 | 6.000～>256.000 | 69.2 | 66.7 | 72.7 | 0.219 | 0.639 9 |
| 四环素 | 0.380 | 0.125～64.000 | 30.8 | 43.3 | 13.6 | 5.255 | 0.021 9 |
| 利福平 | 0.006 | 0.004～>32.000 | 1.9 | 3.3 | 0 | 1.000 0a | |
| 夫西地酸 | 0.125 | 0.031～0.500 | 0 | 0 | 0 | － | － |
| 莫匹罗星 | 0.062 | 0.031～1.000 | 0 | 0 | 0 | － | － |
| 替加环素 | 0.500 | 0.125～0.500 | 0 | 0 | 0 | － | － |
| 万古霉素 | 0.750 | 0.500～1.500 | 0 | 0 | 0 | － | － |
| 利奈唑胺 | 2.000 | 2.000～4.000 | 0 | 0 | 0 | － | － |
| 多重耐药 | － | － | 86.6 | 86.7 | 86.4 | 0.001 | 0.974 8 |
注：SSTIs：皮肤软组织感染；MRSA：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌；MSSA：甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌；MIC：最低抑菌浓度；aFisher′s确切概率法 SSTIs：skin and soft tissue infections；MRSA：methicillin－resistant Staphylococcus aureus；MSSA：methicillin－susceptible Staphylococcus aureus；MIC：minimum inhibitory concentration；aFisher′s exact test
共检测到21株pvl基因阳性金黄色葡萄球菌分离株(21/52株，40.4%)。MRSA和MSSA分离株pvl基因携带率的差异无统计学意义(P>0.05)。此外，还检测到2株eta基因阳性菌株(MRSA、MSSA各1株)、6株etb基因阳性菌株(MRSA、MSSA各3株)及5株tsst-1基因阳性菌株(MRSA 2株，MSSA 3株)，52株分离株中均检测到hlg基因。结果见表2。2例葡萄球菌性烫伤样皮肤综合征患儿的临床分离株中均检测到eta及etb基因。
儿童金黄色葡萄球菌SSTIs临床分离株毒力基因携带情况[株(%)]
Prevalence of toxin genes among Staphylococcus aureus strains isolated from children with SSTIs[strain(%)]
儿童金黄色葡萄球菌SSTIs临床分离株毒力基因携带情况[株(%)]
Prevalence of toxin genes among Staphylococcus aureus strains isolated from children with SSTIs[strain(%)]
| 毒力基因 | 总数 | MRSA | MSSA | χ2值 | P值 |
|---|---|---|---|---|---|
| pvl | 21(40.1) | 11(36.7) | 10(45.5) | 0.407 | 0.523 4 |
| eta | 2(3.8) | 1(3.3) | 1(4.5) | 1.000 0a | |
| etb | 6(11.5) | 3(10.0) | 3(13.6) | 0.164 | 0.685 1 |
| tsst-1 | 5(9.6) | 2(6.7) | 3(13.6) | 0.709 | 0.399 6 |
| hlg | 100(100.0) | 30(100.0) | 30(100.0) | － | － |
注：SSTIs：皮肤软组织感染；MRSA：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌；MSSA：甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌；aFisher′s确切概率法 SSTIs：skin and soft tissue infections；MRSA：methicillin－resistant Staphylococcus aureus；MSSA：methicillin－susceptible Staphylococcus aureus；aFisher′s exact test
新生儿及婴儿免疫功能尚未发育完善，包括皮肤黏膜等在内的非特异性免疫屏障功能差，易造成SSTIs。美国一项研究显示，1岁以下婴幼儿是金黄色葡萄球菌SSTIs的高发人群，发病率达41.4%[12]，这与本研究报道一致。在美国，引起儿童金黄色葡萄球菌SSTIs最常见的疾病为脓肿和蜂窝织炎[13]；我国一项多中心调查中显示，我国儿童最常见社区获得性(community－associated，CA)金黄色葡萄球菌SSTIs为脓疱疮和葡萄球菌性烫伤样皮肤综合征[14]，而本研究金黄色葡萄球菌SSTIs病种多样化，主要为新生儿脐炎和脓肿，此外还有坏死性筋膜炎等深部的SSTIs，这在临床中需引起重视。本研究结果显示，MRSA与MSSA分离株在不同年龄组及病种方面的差异无统计学意义，这可能与本研究菌株数目相对较少，而疾病种类多有关。
分子生物学分型主要包括MLST、SCCmec和spa分型，它对监测菌株遗传背景、同源性，确定爆发流行菌株的基因型及扩散趋势具有重要意义。在世界不同地区，MRSA SSTIs临床分离株的分子生物学分型不同。美国主要以ST8(USA300)为主，欧洲以ST80为主，中国台湾地区以ST59为主，而上海地区则以ST338为主[2,15,16,17]。本研究中主要的ST流行型别为ST59，占73.3%，而2017年刘盈等[18]的多中心研究则报道ST121为最主要流行型别，且多分布在东北、华北、华南和西南4个地区的6家儿童医院，与本研究不一致。这说明在我国不同地区其流行型别亦不同。因此未来需要开展更多相关的多中心研究，以了解我国不同地区儿童MRSA SSTIs临床分离株的分布情况。
本研究中MSSA SSTIs临床分离株共发现10种ST型别，与MRSA相比，表现出更多样化的遗传背景。在俄罗斯、德国及新加坡等地，ST22是MRSA，特别是院内获得性(hospital－associated，HA)-MRSA分离株的主要流行克隆[19,20,21]。而Masiuk等[22]报道，pvl(＋)-ST22型是疖患者分离出的MSSA菌株中最常见的ST型别。本研究结果显示，ST22型仅在MSSA SSTIs临床分离株中发现，且为其主要ST型别，占27.3%。同时值得注意的是，ST59通常被认为是我国儿童CA-MRSA的主要流行克隆[23]。本研究在MRSA与MSSA SSTIs临床分离株中均检测到了ST59型。在中国台湾地区，ST59-MSSA菌株约占ST59型金黄色葡萄球菌的8.8%[24]；在我国上海地区肺炎儿童中分离的MRSA与MSSA菌株中也均发现了ST59型[25]。Hung等[24]研究发现克隆复合体(CC)59 MSSA通过获得不同的可移动基因元件，从而进化为CC59 MRSA并获得不同耐药性及毒力。这可能也揭示了MSSA ST22/ST59作为MRSA ST22/ST59菌株出现的"储蓄池"作用。
SCCmec是一种携带mecA基因的可移动基因元件，是MRSA的特征性分子结构。目前根据mec复合体及ccr复合体的不同，可将MRSA分为11种SCCmec型别(Ⅰ～Ⅺ型)。通常SCCmec分型被认为是区分HA-MRSA和CA-MRSA的一项重要分子标志，HA-MRSA携带SCCmec Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型，而CA-MRSA则携带SCCmec Ⅳ、Ⅴ和Ⅶ型。本研究中，儿童SSTIs MRSA临床分离株最主要流行克隆是ST59-MRSA-SCCmecⅣa-t437，这与本课题组前期报道一致[26]，这说明该MRSA分离株可能是社区来源。但近年来不断报道HA-MRSA和CA-MRSA之间的界限不明确，Song等[27]在亚洲多国的CA-MRSA菌株中检测到SCCmec Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型菌株；而Orendi等[28]则发现HA-MRSA菌株携带Ⅳ型SCCmec。因此不能仅通过分子分型，而应通过临床特征来确定菌株来源。
目前外科干预及抗生素仍是治疗SSTIs最主要的措施。Ruhe等[29]研究发现，及时、有效的抗生素治疗可提高MRSA SSTIs的治愈率。因此加强对金黄色葡萄球菌SSTIs临床分离株药物敏感性的监测，合理选择抗生素十分必要。本研究中，儿童金黄色葡萄球菌SSTIs临床分离株的多重耐药率达86.6%，对ERY、PEN、CHL及CLI的耐药率均>60%。这与Yu等[30]报道的我国温州地区金黄色葡萄球菌SSTIs临床分离株多重耐药率达72.7%一致，但高于美国的31.0%[31]。在美国和欧洲地区，由于CLI在皮肤和伤口渗出液中分布良好，所以常被用来治疗葡萄球菌SSTIs[32]。本研究中，MRSA和MSSA分离株对ERY和CLI的耐药率均高，因此在临床治疗金黄色葡萄球菌SSTIs时应根据药敏试验结果选择合适的抗生素。本研究中菌株均对SXT、MUP、FUS、TGE、LNZ及VAN敏感，提示上述药物可作为金黄色葡萄球菌SSTIs初始经验治疗的首选药物。值得注意的是，本研究发现2株ST59型MRSA分离株同时对8种抗生素耐药。上海地区也报道了多重耐药的ST59-MRSA菌株[33]。这提示，ST59型分离株耐药性比其他克隆型高，临床对ST59型菌株用药须提高警惕，为阻止其传播，需进一步监测其耐药性及流行情况。
自20世纪60年代MRSA出现以来，万古霉素被认为是治疗MRSA感染"最后的防线"。但万古霉素对MRSA的MIC逐年上升，形成MIC"漂移"现象，导致临床治疗失败率增加[34]。本研究中，所有菌株对万古霉素敏感，MIC50为0.75 mg/L，较本课题组2013年的报道升高[35]。因此需要监测菌株万古霉素MIC变化，及时调整药物剂量，提高MRSA感染治愈率。
金黄色葡萄球菌所致SSTIs的表现与其产生的多种外毒素相关。如中毒休克综合征毒素-1(toxic shock syndrome toxin-1，TSST-1)，与葡萄球菌中毒性休克综合征密切相关，可引起皮肤脱皮及多器官衰竭[36]。表皮剥脱素A和B(exfoliatin A and exfoliatin B，ETA和ETB)则与葡萄球菌烫伤样皮肤综合征有关，可引起局部和全身的水疱形成[37]。本研究中，2例葡萄球菌性烫伤样皮肤综合征患儿的临床分离株均检测到eta及etb基因。杀白细胞素(Panton-Valentine leukocidin，PVL)和γ-溶血素(γ-hemolysin，Hlg)主要破坏免疫细胞，如多核细胞和巨噬细胞，从而引起皮肤软组织脓肿形成[38]。既往报道pvl基因在CA-MRSA中的携带率明显高于MSSA[39]，但近期在法国出现了pvl(＋)-MSSA SSTIs的暴发[40]。本研究中，儿童金黄色葡萄球菌SSTIs分离株pvl基因携带率为40.4%，与我国武汉地区报道一致[41]。并且MRSA和MSSA SSTIs临床分离株的pvl基因携带率差异无统计学意义，因此，除pvl(＋)MRSA菌株外，还需加强对我国pvl(＋)-MSSA菌株的监测。
综上，本研究中儿童金黄色葡萄球菌SSTIs常见于新生儿脐炎及脓肿，其多重耐药率高，经验性治疗中不宜首选红霉素和克林霉素。MRSA和MSSA SSTIs临床分离株pvl基因携带率均较高。ST59-MRSA-SCCmecⅣa-t437是MRSA分离株最常见流行克隆，而MSSA分离株的遗传背景更多样化。
