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血友病是一类遗传性出血性疾病，包括血友病A（HA）和血友病B（HB），分别表现为凝血因子Ⅷ（FⅧ）和凝血因子Ⅸ（FⅨ）的缺乏。目前，终身外源性凝血因子替代治疗仍为血友病主要治疗手段。血友病具有单基因遗传病和凝血因子不需要精确调控等特点，基因治疗为治愈该病带来希望。本文就血友病基因治疗的临床研究及面临的问题和挑战进行综述。
应用基因载体的目的是将目的cDNA转移至靶细胞中，使靶细胞持续稳定表达该传递基因。根据作用特点的不同，常用的基因载体分为整合型载体和非整合型载体。整合型载体（如慢病毒和逆转录病毒）能够将转基因整合入靶细胞DNA并实现基因向子细胞传递。因此整合型载体适用于快速分裂的细胞（造血干细胞等），但增加了插入诱变的潜在风险。腺相关病毒（AAV）等非整合型载体在靶细胞中以载体DNA多连体的形式存在，插入诱变风险较小，但为实现转基因蛋白长期表达其靶细胞必须为有丝分裂后的细胞（如肝细胞、神经细胞或肌细胞）。AAV载体是近期的研究热点。
AAV是一种依赖腺病毒进行复制的细小病毒，具有约4.7 kb单链DNA，尚未发现它与人类任何已知的感染性疾病存在相关性。目前广泛认为AAV载体是血友病基因治疗最安全且最合适的病毒载体，它具有以下几个特点：①能够感染不分裂细胞；②以游离多连体的形式维持载体基因组（最小化插入诱变的风险）；③免疫原性较低；④具有多种衣壳血清型可以向不同靶组织转导基因。
FⅨ cDNA约0.9 kb，是AAV向人体转移良好的候选基因。HB基因治疗的早期研究利用AAV将基因转移至人和动物模型的骨骼肌中。在10年前的一项临床试验中，Buchlis等[1]实现了安全地向携带错义突变患者的肌肉组织转移hFⅨ，证明AAV体内基因治疗的可行性。然而，尽管10年中肌纤维持续存在，但任何剂量组的FⅨ表达从未达到治疗水平。目前，大部分HB的研究已经以肝脏作为靶器官。肝脏是FⅧ和FⅨ的产生部位，较肌细胞分泌凝血因子更高效，转基因表达水平更高[2]。
Nathwani等[3]将携带密码子优化的人类FⅨ（hFⅨ）cDNA的AAV8载体通过外周静脉给予6例重度HB患者（FⅨ活性<1%）。以载体低、中、高剂量将患者分为三组，在低剂量组（2×1011vg/kg），患者FⅨ表达量为1%~2%。在高剂量组（2×1012vg/kg），FⅨ表达量为8%~12%。FⅨ虽达到峰值但未持续，在载体注入2个月时，1例患者出现FⅨ水平下降伴肝脏转氨酶水平升高，予糖皮质激素治疗后转氨酶水平快速恢复正常。Nathwani等[4]还报道了10例患者基因治疗后3~4年期间FⅨ维持在1%~6%，减少至少90%的出血发作及预防性FⅨ制剂的使用，尚未发现任何治疗相关不良反应，该研究仍在继续。
目前，多个HB基因治疗产品的Ⅰ/Ⅱ期临床试验均利用AAV载体转运目的基因至人体，通过定期追踪HB受试者情况来探究不同重组载体转基因治疗的安全性及有效性。重组AAV（rAAV）是被移除编码病毒蛋白DNA的细小病毒，各试验的不同之处在于，使用单链rAAV（ssrAAV）还是自我互补型rAAV（scrAAV）、不同的衣壳类型及是否采用FⅨ Padua变体。George等[5]报道了其试验中10例HB（FⅨ活性≤2%）受试者给予相同剂量基因载体，FⅨ表达活性稳定在14%~81%。
人类FⅧ（hFⅧ）基因编码序列全长9 kb，只有接近野生型AAV的基因长度（4.7 kb）才能将其更高效地包装，这种载体容量的限制给HA基因治疗的研究带来挑战。Hey等[6]研究利用B结构域切除的hFⅧ cDNA（BDD-hFⅧ），该基因较野生型hFⅧ小40%，但依然保留辅因子活性并且目前没有发现增加抑制物发生的风险。rAAV可以携带长约5 kb的DNA序列，适合FⅨ（1.5 kb）以及BDD-hFⅧ（4.4 kb）的cDNA转运。另外，hFⅧ存在低效合成的本质特性，hFⅧ在细胞内加工过程中主要在成对的碱性氨基酸切割酶（PACE）或弗林蛋白酶切割位点切割，产生作为分泌蛋白质主要形式的异源二聚体。Nguyen等[7]报道了一种新型能够提高FⅧ表达的弗林蛋白酶缺失hFⅧ变体，减少了基因治疗过程中载体的剂量，与BDD-hFⅧ相比并不增加免疫原性。
近日，美国FDA授予BioMarin Pharmaceutical公司HA基因疗法valoctocogene roxaparvovec（BMN 270）突破性疗法认定，欧洲药品管理局（EMA）也为其颁发了PRIME认定。在动物模型中，该疗法能将FⅧ活性恢复到正常水平。BioMarin Pharmaceutical公司于2017年公布了关于重度HA患者基因治疗的Ⅰ期和Ⅱ期临床试验（NCT02576795）结果[8]，研究者将携带密码子优化的BDD-hFⅧ的AAV5载体（BMN 270）输入15例HA患者体内，所有剂量组均能良好耐受，未发生FⅧ抑制物，最常见的不良反应包括：丙氨酸转氨酶水平升高（10例），关节痛（7例），后背痛（5例），乏力伴头痛（5例）。在超过1年的监测过程中，高剂量组（6×1013 vg/kg）中位FⅧ活性为89%；中等剂量组（4×1013vg/kg）FⅧ表达水平低于高剂量组；在第36周，中等剂量组6例患者中有5例FⅧ水平达到正常范围；4周后，中等剂量和高剂量组的中位年出血率和外源性FⅧ使用率均为0。
目前限制血友病基因治疗广泛应用的主要障碍之一是人群中约30%~40%的个体存在AAV抗体[9]。为了克服人体对AAV产生的体液免疫，研究者们尝试应用以下几种方法：①受试者中不纳入存在抗体的个体；②使用空衣壳；③使用自然存在或生物工程技术处理后免疫抑制的AAV血清型；④血浆置换；⑤局部灌注使靶组织与体循环隔离；⑥增加载体剂量。Calcedo等[10]研究表明婴儿AAV8血清阳性率低于成人，并从理论上推断利用AAV载体进行基因治疗的理想时机是出生后7~11个月。婴儿将成为基因治疗最佳候选者，更早的FⅨ稳定表达可以预防关节出血的发生及向关节病的发展。但是，利用AAV载体进行基因转移，在肝脏发生变化的情况下（如儿童患者在发育的前4~5年肝脏体积会增大4倍）以及患有肝炎、肝硬化等肝脏疾病的患者，这种载体基因的肝内表达能否继续维持及是否安全仍是目前研究尚未解答的问题。有研究报道AAV2插入诱变与人类肝癌的发生存在相关性[11]。不同的AAV血清型在感染性及肝毒性方面具有显著不同。AAV载体主要以游离形式存在于体内，因此，细胞的分裂将稀释AAV携带的基因并最终导致治疗效果的减弱。由于成人肝细胞大部分处于静止期，利用AAV载体进行血友病基因治疗目前仅应用于成年患者。表1为应用AAV载体HB基因治疗临床试验最新进展总结。
血友病B基因治疗临床试验总结
血友病B基因治疗临床试验总结
| 注册号 | 转基因 | 载体 | 载体转移 | 表达情况 | 不良反应 |
|---|---|---|---|---|---|
| NCT00979238 | 密码子优化的FⅨ | AAV8 | 静脉注射 | 所有受试者呈剂量依赖性表达，随访>6年FⅨ维持1%～6% | 10例患者中4例在第6～10周时出现暂时性转氨酶升高 |
| NCT01687608 | 包含Padua突变的密码子优化的FⅨ | AAV8 | 静脉注射 | 高剂量组7例受试者中1例FⅨ维持20%，其余受试者仅短暂表达 | 2例高剂量组患者在第4～8周时出现暂时性转氨酶升高 |
| NCT02484092 | 包含Padua突变的密码子优化的FⅨ | AAV-SPK-100 | 静脉注射 | 10例患者注射后14周实现转基因表达，随访>2年FⅨ稳定表达15.2%～52.2% | 10例患者中2例出现暂时性转氨酶升高 |
| NCT02396342 | 密码子优化的FⅨ | AAV5 | 静脉注射 | 5×1012、2×1013 GC/kg剂量组（各5例）随访>1年，FⅨ平均值分别为4.6%和7.1% | 10例患者中3例在第6～10周出现暂时性转氨酶升高 |
| NCT02618915 | 密码子优化的FⅨ | AAVrh-10 | 静脉注射 | 1.6×1012 GC/kg剂量组3例患者于第8～14周FⅨ达到峰值（5%～11%），5.0×1012 GC/kg剂量组3例患者在第3～8周FⅨ达到峰值（12%～20%） | 6例患者中5例出现暂时性转氨酶升高 |
注：GC/kg：基因组拷贝数/kg
慢病毒载体（LV）是一种逆转录病毒载体，是在人类免疫缺陷Ⅰ型病毒（HIV-1）基础上发展而来的高效载体。区别于一般的逆转录病毒，LV具有感染非分裂细胞的能力，它能够包装大片段目的基因（9~10 kb），将其整合至靶细胞基因组并长期稳定表达。LV还表现出比一般的逆转病毒载体更高的安全性。
造血干细胞（HSC）收集及再导入过程相对较易，故成为目前LV最常用的靶细胞。目前这种方式更多地被应用于HA的基因治疗，在HB离体基因转导的研究中亦有相关报道[12]。血液中近90% FⅨ储存在血小板中，大部分在血小板活化时被释放[13]。Chen等[14]利用LV将携带血小板定向FⅨ（2bF9）基因转导至HSC，再将HSC植入FⅨnull小鼠模型中，观察到小鼠体内血小板FⅨ持续表达并达到治疗水平。转导后6%~39%的血小板表达FⅨ，使FⅨnull小鼠剪尾模型出血情况得到充分控制，并且所有转导的个体均未观察到抗FⅨ抗体出现。免疫原性和插入诱变风险是目前利用LV进行基因治疗能否广泛应用最为关注的问题。
新近的研究发现一种口服非病毒传递基因的新方法[15]。它是一种包装在壳聚糖纳米粒中编码F9的质粒DNA，在HB小鼠模型中，这种方法能够提高FⅨ活性并纠正凝血障碍，特别是当使用过度活化的FⅨ变体时。
为了克服载体转移FⅨ和FⅧ cDNA安全性、持续性等方面的局限，血友病基因治疗的研究越来越多地关注于基因编辑及修复。该方法不仅可以在原位修复致病基因，也可将目的基因敲入指定位点，实现目的基因的异位表达。目前常用的基因编辑技术包括传统的同源重组技术、锌指核酸酶（ZFN）、转录激活因子样效应因子核酸酶（TALENS）和常间回文重复序列丛集及相关蛋白系统（CRISPR-Cas9）等。
ZFN包含共同的Cys2-His2 DNA结合结构域和FokⅠ限制性内切核酸酶的DNA剪切结构域。在HB基因治疗的研究中，利用ZFN方法修复FⅨ基因采用的是三元载体系统，在白蛋白基因位点处剪切及插入FⅨ cDNA。SB-FⅨ是ZFN介导的通过AAV载体运载的基因编辑手段。Sangamo Biosciences研究组正在进行的临床试验通过监测重度HB患者中的FⅨ表达情况，评估不同剂量SB-FⅨ的安全性、耐受性、对FⅨ抗原的影响以及其活性水平，临床试验相关结果尚待公布。
TALEN是来源于植物病原菌黄单胞菌属的天然蛋白质，其DNA结合结构域由33~35个保守的氨基酸重复基序组成，每个基序能识别特定的核苷酸。通过改变重复的氨基酸识别基序，TALEN可针对特定DNA序列。CRISPR-Cas9与ZFN和TALEN蛋白导向的DNA切割不同，依赖小RNA进行序列特异性切割。近年来，CRISPR-Cas9研究发展迅速，逐渐成为ZFN和TALEN基因编辑的替代手段。
Guan等[16]提出利用CRISPR/Cas9技术来修正HB小鼠FⅨ基因，通过高压尾静脉注射裸DNA的HB小鼠超过0.56%的FⅨ等位基因被修正，但由于出现严重肝毒性而未显示出治疗效果。目前注射裸DNA的方法并不适用于人体。CRISPR/Cas9技术克服了AAV载体介导基因治疗的缺陷，即使载体仅在细胞内瞬间存在，基因编辑的效果也会持续存在。
基因治疗作为治愈血友病的最佳途径，全球范围内的研究正在积极进行中，随着其安全性、持久性等问题的解决，血友病基因治疗产品有望在未来十年内上市。
