骨髓增殖性肿瘤（MPN）是一类以一系或多系髓系细胞增殖为主要特征的克隆性造血干细胞疾病，其特点为骨髓有核细胞增多，多不伴有发育异常，外周血红细胞、白细胞、血小板增多，可伴有肝脾大，后期出现骨髓纤维化、骨髓衰竭及转化为急性白血病^[1]。MPN按照bcr-abl融合基因的检测结果主要分为两大类：bcr-abl阳性的慢性粒细胞白血病（CML）和bcr-abl阴性MPN，后者主要包括真性红细胞增多症（PV）、原发性血小板增多症（ET）和原发性骨髓纤维化（PMF）3种经典类型^[1]。疾病特异性的基因突变有助于精确诊断以及促进靶向药物的开发，这在bcr-abl阳性CML中得到了证实。既往对bcr-abl阴性MPN的诊断主要依赖骨髓形态学和组织学检测，而在过去10年中，对这类疾病的研究有了重要的遗传学发现，对其认识有了巨大进展。

2005年有研究发现PV、ET、PMF细胞内存在JAK2 V617F突变^[2,3,4]，之后发现了JAK2 12号外显子和MPL 10号外显子突变^[5,6]，进一步研究表明MPL 10号外显子的体细胞突变（主要累及W515密码子）见于5%的ET和（或）PMF患者^[7,8,9]。这些发现丰富了MPN鉴别诊断的克隆性标志物谱（区别于反应性的骨髓增殖）。JAK2 V617F见于95%以上的PV患者，其他的JAK2突变见于大部分JAK2 V617F阴性PV患者。2008年世界卫生组织（WHO）将JAK2突变纳入到PV的诊断标准中^[1]，而且在60%左右的ET和（或）PMF患者中也可见JAK2突变，故也被列为诊断ET和PMF的参考性标志物^[10]；该诊断标准还将其他的细胞遗传学异常纳入鉴别诊断的参考中，如MPL突变用以区别克隆性和反应性血小板增多或骨髓纤维化^[1]。JAK2和MPL均无疾病特异性，不能有效区分bcr-abl阴性的3种MPN。且在ET和PMF患者中这些基因突变的阳性率明显低于PV患者，仅50%~60%的ET和PMF患者伴有JAK2突变；MPL突变阳性率更低，ET患者为3%~5%，PMF患者为5%~8%^[11]。目前骨髓形态学对于PV诊断已是次要标准，而对于ET和PMF仍是主要依据。

近年来，诸多研究组致力于探讨JAK2和MPL突变双阴性的ET和PMF患者的遗传学基础。2013年12月，两个研究组分别报道JAK2/MPL未突变的ET和（或）PMF患者表达新的CALR基因[编码钙网蛋白（calretculin，CRT）]突变^[12,13]。

2013年，Klampfl等^[12]通过全外显子组测序发现JAK2/MPL未突变的PMF患者获得新的CALR突变。Nangalia等^[13]发现在JAK2突变阴性患者中CALR突变的比例高达70%~84%。两个研究组的结果均显示，CALR基因突变见于第9外显子，突变类型为插入或缺失。至今已发现超过50种突变体，最常见的突变体为p.L367fs*46（45%~53%）（1型突变体）和p.K385fs*47（32%~41%）（2型突变体），其见于80%以上的CALR突变患者^[12,13,14]。在PMF患者中1型突变体比2型更常见^[12,13]。

CALR突变仅与ET和PMF相关，与JAK2和MPL突变相互排斥，见于大多数JAK2和MPL突变阴性的ET和PMF患者，见于约20% ET患者及25% PMF患者，这提示CALR突变是仅次于JAK2的第二最常见的驱动突变。依据即将出版的WHO血液系统恶性疾病分类标准，检测CALR突变以及JAK2 V617F和MPL 10号外显子突变，将成为诊断这两种疾病的主要标准^[15]。

CALR基因位于19号染色体19p13.2，包含9个外显子。野生型CALR基因编码的CRT蛋白是一个高度保守的内质网（ER）蛋白，能够形成分子伴侣和维持钙离子稳态，在细胞增殖、分化、凋亡和免疫源性细胞死亡中起到重要作用；该蛋白含有3个结构域，第1个为N结构域（1~180位残基），位于N端的凝集素结合域，其作用为分子伴侣和结合Zn²⁺；第2个为富含脯氨酸的P结构域（181~290位残基），具有高亲和力的Ca²⁺结合位点；第3个为C-结构域（291~400位残基），包含一串带负电的氨基酸残基，具有多个Ca²⁺结合位点，负责Ca²⁺缓冲，以及C端内质网滞留信号（Lys-Asp-Glu-Leu-COO-，即KDEL信号序列）^[16,17,18]。CRT蛋白同时位于ER内外，其生理功能为在ER中结合折叠错误的蛋白质，阻止其转运到高尔基体^[19]，并影响多种细胞功能，如脂质和蛋白质的合成、蛋白质的折叠、Ca²⁺的储存、翻译后修饰以及部分发生于细胞表面、胞质、细胞核及细胞外基质的活动^[16,17,19]。

CALR突变均发生于9号外显子，为碱基对（bp）的缺失或插入。有两种CALR突变体约占全部CALR突变体的80%：1型突变体（p.L367fs*46）是52 bp缺失，更多见于PMF，2型突变体（p.K385fs*47）是5 bp TTGTC的插入，该两种突变体最为常见，而其余的突变极具异质性^{[12,13,14,20]}。在Klampfl等^[12]的研究中，1、2型突变体分别占所有CALR突变体的53%和32%，而在Nangalia等^[13]的研究中则分别为45%和41%。针对中国人的PMF患者分子变异谱的研究发现，CALR突变者比例与国外报道类似^[14,21]。

所有的CALR突变均引起1个碱基对的读码框移位，导致CRT蛋白C端结构发生改变，产生一个突变的含有36个氨基酸的C端尾（野生型C端为27个氨基酸）^[12,13,20]。发生了突变的CRT蛋白不仅C端酸性结构域及KDEL信号丢失，而且包含多余的带正电氨基酸，如精氨酸、甲硫氨酸，导致其由原来的带负电变成带正电。该蛋白的Ca²⁺结合功能被破坏，其在细胞亚结构中的位置发生改变^[12,22]。

CALR与JAK2/MPL突变阳性患者或JAK2/MPL/CALR突变三阴性患者相比，伴有CALR突变的患者表现出不同的临床特征。

研究发现，与JAK2突变患者相比，伴有CALR突变的ET患者，具有更低的血红蛋白（Hb）水平、白细胞计数（WBC）和血栓风险，更高的血小板计数（Plt），以及更长的生存期；相应的PMF患者也具有相同表现^[12,13,23]。另有研究也显示CALR突变的ET患者常见于中年男性，其Plt更高，Hb水平、WBC以及血栓风险均更低^[24]。Rumi等^[25]发现与JAK2突变患者相比，CALR突变患者的总体生存期、转白血病或转骨髓纤维化的风险均差异无统计学意义，但其无血栓生存率更高。其另一项研究也发现，伴有CALR突变的家族性ET患者的血栓累积发生率和疾病进展率更低^[26]。总之，CALR突变的ET患者发生血栓的风险低于JAK2突变者^{[12,22,23,24,25,26]}。

随后研究进一步证实了上述结论。Haslam和Langabeer^[27]的研究招募了144例发生内脏静脉血栓（SVT）的MPN患者，其中JAK2 V617F突变患者所占比例为18.8%，而未检出CALR 9号外显子突变。Turon等^[28]的研究报道了209例JAK2突变患者SVT的发生率为82.4%，而CALR突变患者仅为5.4%。

Klampfl等^[12]在研究中比较了JAK2、MPL和CALR突变PMF患者的生存时间，CARL突变患者的预后明显优于JAK2或MPL突变患者。这在随后得到了证实，Tefferi等^[10]对254例PMF患者进行研究，与伴有其他突变的患者相比，CALR突变患者的中位年龄更小[57岁（32~82岁），>60岁患者仅占14%]，Plt更高，动态国际预后评分系统-plus（DIPSS-plus）评分更低；CALR突变患者较少出现严重贫血、依赖输血治疗和WBC增多。在多因素分析中，CALR突变患者预后更好，CALR突变是影响预后的独立因素，其不依赖DIPSS-plus评分和ASXL1突变状态^[10]。并且与JAK2突变及2型CALR突变体患者相比，伴有1型CALR突变体的患者生存期更长^[29]。国内的一项研究也进一步佐证了这一现象^[30]。最新的一项Meta分析也证实CALR突变可作为PMF预后良好的预测因素^[31]。而JAK2/MPL/CALR三阴性PMF患者的预后非常差，具有极高的向白血病转化的风险^[10]。

CALR突变的发现丰富了bcr-abl阴性MPN分子遗传学的标志谱，对研究ET与PMF的发病机制、疾病诊断、预后评估等有非常重要的意义。然而CALR突变导致MPN发生的机制仍在研究中。

驱动突变是指基因组发生异常对具有自我更新能力的细胞优势选择，导致克隆性突变细胞的形成^[32]。驱动突变分为起始突变和形成突变，前者突变产生新的恶性克隆，后者在已经形成的克隆性细胞中产生协同突变，介导疾病进展。在MPN发生过程中，JAK2、MPL和CALR突变的作用更接近形成突变，产生了不同的MPN表现型，即这些基因突变不是导致这类疾病发生的最初始事件，更可能是疾病发生的第二事件^[4]。Delhommeau等^[33]发现在MPN患者的造血干细胞中TET2突变早于JAK2突变，这一现象在Lundberg等^[34]的研究中也得到证实；伴有TET2突变患者的DIPSS-plus评分多为高危组^[35]。

CALR突变仅见于ET和PMF，是以巨核细胞异常为主的疾病^[25,36]。CALR突变和髓系肿瘤中的血小板增多密切相关，这提示CRT蛋白突变最开始是影响了巨核细胞的生物学特性。各种不同的研究表明巨核细胞在MPN的疾病进程中起到了重要作用，特别是介导骨髓纤维化^[37]。在PMF中，CD34阳性细胞分化成巨核细胞的能力明显增强^[38]，而且驱动突变改变了巨核细胞的分化、迁徙能力以及血小板生成能力，导致血小板产生明显增加^[39,40]。有研究证实，在正常情况下，巨核细胞促进骨髓基质环境表达纤连蛋白、Ⅳ型胶原和层黏连蛋白^[41]，这在骨髓纤维化的进程中至关重要。

有研究发现，不论患者的临床诊断或伴有何种驱动突变，所有的MPN患者都存在JAK2信号通路活化^[42]。在白细胞介素（IL）-3依赖的鼠Ba/F3细胞株体外实验中发现，表达CALR1型突变体的Ba/F3细胞出现非细胞因子依赖性生长，JAK-STAT信号转导因子及STAT5活化因子的活化，并且这些过表达CALR突变的细胞对JAK2抑制剂Fedratinib敏感^[12,22]。这一发现符合JAK2抑制剂治疗PMF有效的现象，不管PMF患者为何种基因型，其对JAK抑制剂的治疗均有一定反应^[43]。目前已有临床试验证实，使用JAK1、JAK2抑制剂ruxolitinib治疗PMF患者有效，患者脾脏直径缩小，症状减轻^[44,45]。故CALR等驱动突变通过激活巨核细胞内的JAK-STAT通路，介导了最初的Plt增多及最终的骨髓纤维化。

研究进一步发现，CALR突变上调表达巨核细胞分化标志物NF-E2、CD41和血小板生成素受体（MPL），其中NF-E2为巨核细胞的关键转录因子，这一系列改变激活下游STAT信号通路^[19]。CALR突变产生的蛋白质稳定性差，被非依赖蛋白酶体的途径所降解，而过表达的MPL稳定了CALR突变蛋白，促进下游通路的持续活化^[19]。最新研究发现CALR突变需要MPL来激活JAK-STAT通路驱动转化^{[46,47,48,49]}。目前观察到的所有CALR突变体均产生同一个新的C端肽链尾，而CALR基因9号外显子的完全缺失反而不会导致MPN发生^[47]，这提示了CALR突变是功能获得性（GOF）突变，而这个C端起到了关键作用。Elf等^[48]证实CALR突变介导疾病发生是依赖于突变蛋白的C端带正电，其为CALR突变和MPL相互作用的必要因素。可能由于CALR突变体失去了带负电的氨基酸，则丧失了Ca²⁺滞留能力，进而促进并稳定了与MPL的相互作用^[50]。最近研究发现，CALR突变介导的体外细胞转化需要MPL的胞外段糖基化，提示MPL糖基化影响其与CALR突变相互作用的能力^[46]。上述研究结果为CALR突变诱导MPN发生提供了一个新的病因学解释。但突变的CALR C端如何促进MPL结合其他Ⅰ型细胞因子受体，以及这一相互作用如何活化JAK-STAT信号转导通路的具体机制仍有待进一步研究。

CALR突变的发现对于MPN的治疗提供了一个新的疾病诊断和预后评价的分子标准，CALR突变将成为诊断ET和PMF的主要标准之一^[15]，对临床实践有重要的指导意义。

对于伴有JAK2 V617F及MPL 10号外显子突变的MPN患者而言，SVT是常见而严重的并发症。常见的血栓性并发症有：布加综合征、肠系膜静脉血栓、门静脉血栓、下肢深静脉血栓等。已有研究表明CALR突变患者血栓风险明显下降，而该类患者在接受低剂量阿司匹林抗血小板治疗后，其血栓风险无明显变化，反而增加了出血发生率^[51]。尽管已有多项研究结果，但是CALR突变在血栓风险评估中的价值依然存在争议。有研究建议临床实践中筛查CALR突变，以利于SVT风险评估和抗血小板治疗的选择^[52]。但仍有研究认为CALR突变患者年龄较JAK2突变者更小，其血栓事件发生率本就偏低，年龄这一混杂因素导致了偏倚^[53]，故CALR突变与血栓风险的相关性需要进一步探讨研究。

CALR突变PMF患者预后良好，CALR突变作为患者预后良好的独立预测因子^[10]，有助于完善PMF的MICM诊断体系，为PMF提供全新的分子诊断依据，更有助于PMF的预后分层，帮助临床制定更加个体化的治疗方案。

由于CALR突变通过激活JAK-STAT通路来活化造血细胞的增殖，对于JAK抑制剂的治疗有一定反应，但是JAK抑制剂对CALR突变的特异性选择还不明确，对该方案治疗CALR突变患者的疗效不宜过早下结论。和治疗JAK2阳性患者一样，该类药物存在诸多不良反应，因此针对CALR突变更具选择特异性的新手段有待研究。期待CALR突变本身可作为靶向治疗的靶点，开启MPN分子治疗的又一新途径。

然而，CALR突变并没有完全填补JAK2/MPL突变阴性疾病的分子学空白，也不能完全区分ET和早期/纤维化前期PMF。部分患者表现为JAK2/MPL/CALR突变三阴性，其预后极差，有极高向白血病转化的风险^[10]，而这背后的发病机制及分子遗传学异常并不清楚。对这部分患者的治疗应当选择更为积极的方案，异基因造血干细胞移植是唯一有效的手段。