阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)是一种后天获得性造血干细胞基因突变引起的溶血性疾病，主要临床表现为血管内溶血、全血细胞减少和血栓形成。其中，血栓形成为PNH最常见的严重并发症，亦是导致PNH患者死亡的主要原因。阐明PNH患者血栓形成的病理生理机制，有助于预防和治疗PNH的血栓相关并发症。因此，笔者拟就PNH患者溶血与非溶血状态下，补体系统、游离血红蛋白(fHb)、NO、血小板及凝血因子等异常，在PNH患者血栓形成过程中作用的相关研究进展进行综述，旨在阐明PNH患者血栓形成的病理生理机制，为PNH相关研究及其临床治疗提供思路。
版权归中华医学会所有。
未经授权，不得转载、摘编本刊文章，不得使用本刊的版式设计。
除非特别声明，本刊刊出的所有文章不代表中华医学会和本刊编委会的观点。
阵发性睡眠性血红蛋白尿症(paroxysmal nocturnal hemoglobinuria，PNH)是一种后天获得性造血干细胞基因突变引起的溶血性疾病。PNH患者的红细胞表面补体调节蛋白CD55、CD59缺失，导致红细胞对补体的敏感性增加，进而引起补体介导的血管内溶血。血栓形成为PNH最常见的严重并发症，亦是导致PNH患者死亡的主要原因。由于PNH发病机制的特殊性及其慢性血管内溶血病程的复杂性，PNH患者血栓形成的病理生理机制尚未被完全阐明，并且临床对于PNH血栓相关并发症的预防及治疗，亦仅借鉴其他血栓性疾病的抗凝策略。探索PNH患者血栓形成的病理生理机制，有助于提高临床对PNH血栓相关并发症的治疗水平。因此，笔者拟就PNH患者血栓形成的病理生理机制的研究进展综述如下。
PNH的临床特征之一为非典型部位的血栓形成，多见于具有较大PNH克隆(PNH粒细胞比例>50%)或溶血性PNH患者，并且PNH小克隆及非溶血性PNH患者的血栓发生率亦较健康个体高[1,2]。欧美国家研究者报道，29%～44% PNH患者在整个病程中，可能发生1次或1次以上的血栓事件。我国研究者报道，PNH患者血栓发生率亦高达18.4%[3,4,5]。Jang等[6]通过比较亚裔与非亚裔PNH患者血栓相关并发症的危险因素发现，遗传因素是非亚裔PNH患者血栓形成的危险因素之一，而与生活习惯及饮食方式无关。PNH患者血栓形成的部位包括动脉(如颅内动脉、冠状动脉)及静脉，其中静脉为血栓形成的主要部位，如肝静脉(布加综合征)、门静脉、肠系膜静脉、脾静脉及颅内静脉(矢状窦)和下腔静脉，其他部位包括皮肤静脉、肾静脉及肺微血管等。相关报道称，PNH患者静脉血栓发生率约为85.0%，动脉血栓发生率约为15.0%，而多部位血栓发生率为20.5%[7]。PNH患者血栓形成易发生于非典型部位，而非下肢深静脉等常见部位的原因，目前尚未阐明。有研究者推测，腹部静脉系统易形成血栓的机制为，活化的中性粒细胞容易存活于肝微血管中，因此PNH患者体内CD59－中性粒细胞活化后，定位于肝微血管的可能性较其他部位血管更大，并且CD59－中性粒细胞与已活化的血小板相互作用，通过丝氨酸蛋白酶的释放，激活凝血酶原，促进该部位血小板的促凝活性，从而导致腹部静脉系统血栓形成[8]。另有研究者认为，腹部血管肌层高表达限制性提呈脂类/糖脂类抗原的CD1d，导致腹部血管肌层更易被PNH患者体内异常的T淋巴细胞攻击，从而诱发腹部静脉血栓形成[9]。
PNH主要表现为慢性血管内溶血，其病程存在溶血与非溶血2种病理状态，PNH患者在溶血与非溶血状态下均易发生血栓相关并发症，并且溶血性PNH患者的血栓相关并发症发生率较非溶血患者高。PNH患者在溶血状态下，针对血栓形成的研究热点主要集中于补体系统异常活化，游离血红蛋白(free hemoglobin，fHb)毒性，NO消耗及血管内皮细胞损伤与功能障碍；而非溶血状态下，针对血栓形成的研究热点则集中于补体活化产物、凝血和纤溶系统功能异常，以及糖基化磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidyl-inositol，GPI)锚链的凝血调节蛋白异常等方面。PNH患者血栓形成的病理生理机制十分复杂，其血栓形成并非由某单一因素介导，通常呈现为多因素共同介导的多途径过程。
补体介导的血管内溶血是PNH的主要病理特征，溶血性PNH患者血栓发生率高于非溶血性PNH患者。既往认为，溶血产生的红细胞微粒可导致血栓前状态，但后续研究发现红细胞微粒在PNH患者和健康个体间并无显著差异，因此红细胞微粒在PNH患者血栓形成过程中的作用，尚需进一步研究证实[10]。fHb在溶血性PNH患者的血栓形成中，发挥相当重要的作用，血管内溶血导致fHb过量释放，fHb消耗NO并进一步产生游离血红素。fHb的过量释放和NO的消耗，不仅引起血管内皮细胞损伤，而且直接导致血小板的活化、聚集，最终导致血栓前状态。
越来越多的研究证明，fHb为血小板活化聚集的始动因素。Singhal等[11]研究发现，PNH患者的血浆fHb可通过结合血小板表面糖蛋白GP1bα，直接活化血小板。低浓度fHb能增加信号传导蛋白Lyn、PI3K、AKT及ERK的磷酸化，从而促进血小板聚集；而高浓度fHb则能够活化促凋亡蛋白Bak、Bax、细胞色素C、Caspase-9、Caspase-3，进而促进血小板形成血栓。Da等[12]通过体外循环装置模拟体内的血栓形成过程，发现fHb可直接结合血管性血友病因子(von Willebrand factor，vWF)，通过增加vWF-A1结构域对血小板表面GP1bα的亲和力，诱导血小板大量结合纤维蛋白原或细胞外基质组分(如胶原蛋白)，从而形成血栓。上述研究首次证实，fHb可直接促进血栓形成过程中GP1bα-vWF之间的相互作用，提出了fHb促进PNH患者血栓形成的另一种机制。此外，Zhou等[13]发现，镰状细胞贫血患者的fHb亦可抑制vWF裂解酶(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs，ADAMTS)13的表达，从而减少vWF的裂解。
由于PNH患者溶血产生的过量fHb与NO结合迅速且不可逆，导致大量NO被消耗；血管内溶血同时释放分解L-精氨酸(NO合成底物)的精氨酸酶，导致NO的来源减少，进一步减少PNH患者体内NO。NO易与可溶性鸟苷酸环化酶结合，增加细胞内cGMP含量，后者可活化cGMP依赖激酶，减少平滑肌细胞内Ca2＋浓度，从而舒张血管、增加局部血流。除血管舒张作用外，NO还可与血小板结合，下调血小板表面GPⅡb/Ⅲa的表达，减少血小板黏附于血管内皮细胞表面，并且减少促凝蛋白的分泌，从而发挥抗凝作用。据此，NO的消耗亦被视为PNH患者血小板活化聚集的始动因素。PNH患者因溶血引起体内NO消耗，从而活化血小板，增加可溶性P-选择素的表达水平，而P-选择素可促进补体系统活化，加重溶血而形成恶性循环[11]。另有研究证实，NO可调节FⅫⅠ的功能，NO消耗增加纤维蛋白分解产物及凝血酶-抗凝血酶复合物水平，降低血凝块的可溶性，导致明显的纤维蛋白沉积和血栓形成[14]。PNH患者长期慢性血管内溶血所致的持续低水平NO可诱导血管平滑肌痉挛、血流减少，经上述机制的进一步作用下，易于发生血栓相关并发症。
PNH患者发生溶血后，血红蛋白(hemoglobin，Hb)分解并释放游离血红素和毒性铁(toxic iron)，进而产生自由基，导致细胞膜脂类物质的氧化应激反应，直接损伤血管内皮细胞。长期暴露于游离血红素的内皮细胞及其组织因子(tissue factor，TF)表达水平上调，进一步上调细胞内黏附分子(intercellular cell adhesion molecule，ICAM)1，血管细胞黏附分子(vascular cell adhesion molecule，VCAM)1和E-选择素的表达。此外，血管内皮细胞表面GPI锚链的组织因子途径抑制物(tissue factor pathway inhibitor，TFPI)-β的缺失，可能降低血管内皮细胞的抗凝特性；而活化的血管内皮细胞亦可趋化炎症细胞产生炎症反应。以上多种因素协同作用导致PNH患者血管内促凝效应增强，促进血栓形成[15,16,17]。近期，Belcher等[18]通过研究镰状细胞贫血小鼠模型发现，血红素可通过血红素/TLR4信号通路，迅速诱导血管内皮细胞的Weibel-Palade小体脱颗粒，释放vWF和P-选择素至血管内皮细胞表面，进一步激活核因子-κB介导的凝血和补体级联反应，引发血管栓塞。而早期研究发现，健康志愿者静脉输注血红素，可致血栓性静脉炎、血管炎症及闭塞[19]。此外，PNH患者的GPI缺陷单核细胞被补体攻击后，释放富含TF的微粒，血管内皮细胞吞噬此微粒后，可上调血管内皮细胞微粒(endothelial-derived microparticles，EMP)分泌及TF表达水平。上述研究结果提示，PNH患者由于溶血产生的溶血产物，损伤血管内皮细胞，并进一步引发血管内皮细胞的功能障碍。
虽然PNH患者的溶血与血栓形成密切相关，但是非溶血性PNH患者仍有较高的血栓相关并发症发生率。近期的一项队列研究结果表明，非溶血性PNH患者(乳酸脱氢酶水平<2倍正常值上限)中，高比例粒细胞系PNH细胞(细胞所占比例>30%)、低比例红细胞系PNH细胞(细胞所占比例<10%)患者较低比例粒细胞系PNH细胞(细胞所占比例≤30%)、高比例红细胞系PNH细胞(细胞所占比例≥10%)患者具有较高的血栓发生风险，并且动脉血栓发生率达20%[2]。引起非溶血性PNH患者血栓形成的病理生理机制可能与以下因素相关。
补体活化后形成的膜攻击复合物(membrane attack complex，MAC)引起细胞裂解，MAC和补体C5a的产生诱导TF及纤溶酶原活化抑制物(plasminogen activator inhibitor，PAI)1表达，后者可快速抑制组织型纤溶酶原活化，从而促进血栓形成并抑制纤维蛋白溶解。补体C5a还可通过调节炎症因子和产生白细胞介素(interleukin，IL)-6, -8，以及肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α，促进凝血酶形成及活化血管内皮细胞。此外，IL-6还可抑制ADAMTS13的活性。同时，活化的血管内皮细胞产生的微粒，导致炎症因子得以释放[20]。此外，补体凝集素途径中，甘露聚糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶(mannose-binding lectin-associated serine protease，MASP)-1可激活FⅫⅠ和凝血酶原，从而促进血栓形成，并且诱导血凝块的形成，使其抵抗纤溶降解[21]。另有研究发现，补体C3参与纤维蛋白凝块的形成，提高纤维蛋白凝块的抗纤溶特性[22]。总体而言，补体活化可通过多种途径促进血栓形成。
Eculizumab作为一种补体C5抑制剂，抑制PNH溶血发生的同时，可迅速降低患者血浆中的TF、D-二聚体、凝血酶-抗凝血酶复合物、纤溶酶-抗纤溶酶复合物、IL-6和血管内皮细胞活化标志物(vWF、TFPI)的水平。PNH患者接受eculizumab长期治疗后，其血栓发生率可下降81.8%，其中96.4%的患者未再次形成血栓[23]。van Bijnen等[24]推测，eculizumab可减少白细胞源性TF微粒，进而降低凝血酶和炎症因子水平，增强其对血管内皮细胞的保护效应，并减少凝血系统的活化，最终降低血栓发生率。eculizumab对PNH患者血栓的显著疗效提示，补体活化的促凝机制在PNH血栓形成中的重要作用。虽然目前尚不完全清楚溶血与补体活化在PNH患者血栓形成的机制中的作用孰轻孰重，以及是否存在独立于溶血的血栓形成机制，但随着eculizumab的应用日益广泛，后续的相关研究或可从中获益。
早期研究发现，凝血酶可活化补体C3和C5[25]。近期研究结果证实，血栓形成后产生的纤溶酶亦可催化补体C5裂解释放C5a，并且其催化效率与补体C5转化酶类似，并进一步诱导MAC产生[26]。由此推测，补体活化后促进血栓形成，而血栓形成后可反向激活补体，形成恶性循环，导致部分PNH患者首次血栓形成后，通常会再次发生血栓事件，此时即使预防性使用抗凝药物亦难以避免血栓事件。
单核细胞及中性粒细胞系的PNH细胞因GPI合成缺陷，导致多种与GPI锚链的抗凝和纤溶因子，包括蛋白酶3，TFPI及尿激酶型纤溶酶原激活物受体(urokinase plasminogen activator receptor，u-PAR)等缺失，这些蛋白的缺失可导致血小板和凝血因子的异常活化，影响纤溶过程，从而增加PNH患者的血栓形成风险。蛋白酶3与GPI锚链蛋白CD177(NB1)共表达于细胞表面，二者通过裂解血小板表面的蛋白酶活化受体(protease-activated receptor，PRA)1抑制血小板的活化聚集，从而抑制血栓形成[27]。近期研究表明，PNH患者的血清蛋白酶3水平降低，导致PRA1水平升高，从而引起活化血小板浓度升高[28]。TPFI和u-PAR的缺失，同样造成PNH患者凝血和纤溶系统功能异常。此外，蛋白C和S能与补体C4b结合而发挥抗凝作用，PNH患者体内TF增多、血栓形成或肝功能损伤可导致蛋白C和S的慢性消耗，从而促进或加重血栓形成[29]。研究还发现，中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps，NET)释放的组蛋白可通过减少蛋白C的活化增加凝血酶的产生，并且活化血小板[30]。
综上所述，PNH患者血栓形成的病理生理机制十分复杂，虽是从溶血与非溶血相关机制进行论述，但可看出二者并非完全独立，溶血的发生依赖于补体的活化，而补体的活化亦并非仅引起红细胞溶解，非溶血性PNH患者的血栓形成可能更多源自补体对白细胞和血小板的作用，导致血管内皮细胞受损和凝血、纤溶系统功能异常。PNH患者血栓形成的病理生理机制主要可归纳为：①补体活化攻击红细胞导致溶血并释放fHb，后者清除NO，继而导致血管收缩，并可损伤血管内皮细胞和上调TF的表达；②在补体介导的攻击下，血小板、白细胞可能释放，以及促凝微粒引起血小板活化；③参与纤维蛋白溶解的蛋白缺失和促炎症和促凝血细胞因子水平的增加，亦可能促进PNH血栓形成。
目前对于PNH血栓形成的治疗，通常采用与非PNH患者相似的抗凝药物治疗方案，包括肝素、低分子肝素及华法林等，也有使用新型抗凝药物利伐沙班预防血栓形成的报道[31]，但其效果及安全性均需进一步确证。
通过前文对PNH患者血栓形成病理生理机制的探讨可知，PNH患者体内NO的消耗非常严重，这不仅增加血栓形成风险，还可引起平滑肌功能障碍，临床表现为腹痛、乏力、食管痉挛、阴茎勃起功能障碍等症状。鉴于NO消耗在PNH发病机制中的特殊作用，通过增加NO的产生降低PNH患者的血栓形成风险，同时改善其平滑肌功能障碍，成为PNH治疗的新靶点。作为NO的供体，硝酸酯类药物用于心血管疾病的治疗已逾一个半世纪，早期研究也证明硝酸甘油及其释放的NO可抑制血小板聚集和黏附，具有抗血栓形成作用[32]。但是目前国内外文献均未提及硝酸酯类药物在PNH患者中的潜在治疗作用。虽然NO消耗在PNH的发病机制中处于次要地位，但进一步探索NO替代治疗在PNH中的可行性、有效性及安全性或许值得一试。
血栓形成在PNH患者中发病率高、机制复杂，严重影响患者的生活质量，甚至造成死亡。虽然补体C5抑制剂eculizumab的应用使得PNH患者有望取得与健康人群相当的生存期，对血栓形成的控制疗效亦非常显著，但因各种客观因素，国内仍未能广泛应用。因此，进一步扩大并深入研究PNH患者血栓形成的病理生理机制，不仅有助于对该病的理解，更有助于开发更多的新药控制或预防其血栓形成，提高对PNH的预防和治疗水平。
无
