探讨骨髓增生异常综合征（MDS）患者在接受异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）后基于WT1基因及流式细胞术（FCM）监测微小残留病（MRD）的意义。
分别采用实时定量聚合酶链反应（RQ-PCR）和8色FCM检测2011年2月至2015年10月于北京大学人民医院接受allo-HSCT的MDS患者移植前及移植后骨髓中WT1基因表达及异常免疫表型，并与临床结果进行相关分析。
92例患者中，40例（48.2%）移植后WT1阳性，9例（10.8%）FCM阳性（FCM检测骨髓表型异常髓系幼稚细胞≥0.01%），27例（29.3%）患者MRDco阳性[连续2次WT1≥0.6%（间隔2周）或连续2次FCM阳性（间隔2周）或同一骨髓标本WT1≥0.6%且FCM阳性]。单因素分析显示移植后FCM阳性、MRDco阳性与复发相关（P<0.001，P=0.017）。FCM（+）、FCM（－）组移植后2年累积复发率（CIR）分别为66.7%、1.2%（P<0.001）；MRDco（+）、MRDco（－）组移植后2年CIR分别为23.0%、1.6%（P=0.004）。移植后WT1、FCM、MRDco预测复发的敏感性均为66.7%，特异性分别为59.0%、96.4%、74.7%。
FCM和基于WT1/FCM的MRDco可作为MDS患者MRD监测的有效指标；基于MRDco标准进行干预可降低移植后复发率。
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异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）是治疗包括骨髓增生异常综合征（MDS）在内的血液系统恶性疾病的有效方法，移植后复发仍是导致移植失败的最主要原因之一。有效的微小残留病（MRD）检测手段以及基于MRD的复发干预策略是降低移植后复发的关键。近年来国内外越来越多的研究已逐步证实分子生物学和流式细胞术（FCM）检测可有效监测急性白血病移植后MRD[1,2,3]，其中泛白血病基因WT1及FCM检测的白血病相关免疫表型（LAIP）在急性白血病移植后MRD监测中的意义也逐渐得到认可[4,5]。MDS缺乏特异性基因以及公认的免疫残留标准，其移植后MRD的监测方法及临床意义尚不明确。本研究中，我们对92例MDS患者allo-HSCT前后的WT1基因及MDS相关免疫表型检测结果和预后进行回顾性分析，对其作为MRD监测指标的临床意义进行了探讨。
本研究纳入2011年2月至2015年10月在北京大学人民医院接受allo-HSCT并满足以下条件的MDS患者：①根据WHO修订的MDS国际预后积分系统（WPSS）[6]评估为高危和极高危患者；②在移植前和移植后规定时间点均进行WT1基因和FCM检测的患者。共纳入92例患者，男56例，女36例，中位年龄38（8~60）岁。难治性血小板减少伴多系发育异常（RCMD）12例，难治性贫血伴原始细胞增多（RAEB）-1 27例，RAEB-2 53例。患者一般临床特点见表1。
92例骨髓增生异常综合征（MDS）患者一般情况
92例骨髓增生异常综合征（MDS）患者一般情况
| 临床特点 | 结果 | |
|---|---|---|
| 移植时年龄［岁，M（范围）］ | 38（8～60） | |
| 性别（例，男/女） | 56/36 | |
| 诊断至移植时间［月，M（范围）］ | 5（1～72） | |
| MDS分型［例（%）］ | ||
| RCMD | 12（13.1） | |
| RAEB-1 | 27（29.3） | |
| RAEB-2 | 53（57.6） | |
| 细胞遗传学危险分层［例（%）］ | ||
| 低危 | 10（10.9） | |
| 中危 | 59（64.1） | |
| 高危 | 23（25.0） | |
| 输血依赖［例（%）］ | 56（60.9） | |
| WPSS分型［例（%）］ | ||
| 高危 | 19（20.7） | |
| 极高危 | 73（79.3） | |
| 移植前化疗［例（%）］ | 61（66.3） | |
| 移植前疾病状态［例（%）］ | ||
| CR | 27（29.3） | |
| 未达CR | 65（70.7） | |
| 移植类型［例（%）］ | ||
| HLA同胞全相合 | 28（30.4） | |
| HLA亲缘单倍型 | 60（65.2） | |
| 非血缘 | 4（4.4） | |
| HLA不合位点［例（%）］ | ||
| 0 | 32（34.8） | |
| 1 | 7（7.6） | |
| 2 | 5（5.4） | |
| 3 | 48（52.2） | |
| ABO血型匹配［例（%）］ | ||
| 血型相合 | 54（58.7） | |
| 主要不合 | 16（17.4） | |
| 次要不合 | 12（13.0） | |
| 主要+次要不合 | 10（10.9） | |
| 复发［例（%）］ | 9（9.8） | |
| 非复发死亡［例（%）］ | 10（10.9） | |
| 无病生存［例（%）］ | 73（79.3） | |
| 随访时间［d，M（范围）］ | 568（58～1 904） | |
注：WPSS：WHO预后积分系统；RCMD：难治性血小板减少伴多系发育异常；RAEB：难治性贫血伴原始细胞增多；CR：完全缓解
采用北京大学血液病研究所常规方案[7]，全相合移植采用改良白消安+环磷酰胺或环磷酰胺+全身照射方案，单倍型及非血缘移植加用抗胸腺细胞球蛋白（ATG）。
患者分别在移植前，移植后30、60、90、135、180、270、360 d采集骨髓标本，移植1年后根据患者临床情况每3~6个月进行骨髓检查。
①提取RNA及逆转录：骨髓标本经Na2EDTA抗凝，用相对密度为1.077 g/L的淋巴细胞分离液分离单个核细胞。经TRIzol试剂（美国Invitrogen公司产品）提取总RNA。10 μl逆转录体系中包含2 μg总RNA进行逆转录。②实时定量聚合酶链反应（RQ-PCR）：在ABI Prism7500实时荧光定量PCR反应仪（美国ABI公司产品）上进行。WT1基因序列源自Tamaki的报道[8]，上游引物：5′-GATAACCACACAACGCCCATC-3′，下游引物：5′-CACACGTCGCACATCCTGAAT-3′，探针：FAM-ACACCGTGCGTGTGTATTCTGTATTGG-TAMRA。③内参照基因选用ABL基因。检测方法如上述，albU上游引物Ia：5′-TCCTCGTCCTC CAGCTGTTATC- 3′，Ib：5′- TTATCAAAGGAGCA GGGAAGAAG-3′；ablU下游引物a2：5′-CTCAGACCCTGAGGCTCAAAGT- 3′，探针：FAM-AGCCCT-TCAGCGGCCAGTAGCATCT-TAMRA。④WT1表达水平计算公式：WT1基因表达水平（%）=（WT1拷贝数/ABL拷贝数）×100%，<0.6%为阴性[4]。
采用八色FCM对MDS的MRD进行检测。骨髓标本抗体组合：CD38/CD33/CD34/CD117/CD45/CD13/CD11b/D16抗体标记。
复发包括血液学复发、髓外复发，均通过骨髓细胞形态学或组织病理学检查确诊。FCM阳性：FCM检测骨髓异常髓系幼稚细胞≥0.01%。MRDco阳性：连续2次（间隔2周）WT1≥0.6%或连续2次（间隔2周）FCM阳性或同一骨髓标本WT1≥0.6%且FCM阳性。干预措施：对移植后MRDco阳性患者进行的干预措施包括减停免疫抑制剂、使用干扰素、化疗和（或）供者淋巴细胞输注（DLI）等。患者如有严重的移植物抗宿主病、感染或器官衰竭等暂不进行复发干预。
采用查阅门诊病例和电话方式进行随访。随访截止日期为2016年5月31日，中位随访时间为568（58~1 904）d。总生存（OS）时间指输注造血干细胞至任何原因导致的死亡或随访截止的时间。无病生存（DFS）时间指输注造血干细胞至疾病复发或任何原因导致患者死亡的时间。
采用SPSS 22.0统计学软件，非连续变量用独立样本t检验。生存率的计算采用Kaplan-Meier法，两组生存曲线比较采用Log-rank检验，单因素分析采用卡方检验，多因素分析采用Cox回归模型。以P<0.05为差异有统计学意义。
92例患者中，有9例患者移植后复发（9.8%），均为血液学复发，中位复发时间为移植后167（64~672）d。共有10例（10.9%）患者发生移植相关死亡，中位死亡时间为移植后115（58~457）d，死亡原因包括重症肺炎（3例）、严重移植物抗宿主病（2例）、感染中毒性休克（1例）、弥漫性肺泡出血（2例）、颅内真菌感染（1例）、血栓性微血管病（1例）。
移植前所有患者均进行了WT1和FCM检测，WT1中位表达水平为9.70%（0.05%~90.60%），FCM中位水平为0.75%（0~25.62%）。RCMD、RAEB-1、RAEB-2三组患者的移植前WT1中位水平分别为4.75%（0.11%~55.7%）、9.70%（0.32%~30.40%）、12.30%（0.05%~90.60%），RCMD组WT1表达低于RAEB-2组，但差异无统计学意义（P=0.070）。RCMD组FCM水平明显低于REAB-1、RAEB-2组（P=0.033，P=0.016），而RAEB-1和RAEB-2组之间差异无统计学意义。移植后WT1阳性、FCM阳性与移植前两者的水平无相关性（P=0.439，P=0.928）。
92例患者中共有40例（48.2%）在随访期内出现过WT1阳性，中位阳性时间为137（28~579）d，WT1的中位表达水平为0.96%（0.61%~5.30%）。共有9例（10.8%）患者检出FCM阳性，中位阳性时间为140（59~180）d，FCM中位水平为0.47%（0.01%~2.13%）。随访期内共27例（29.3%）患者达到MRDco阳性标准，中位阳性时间为148（46~409）d。
WT1（+）、WT1（－）组2年累积复发率（CIR）分别为15.7%、7.2%（P=0.069）；FCM（+）、FCM（－）组2年CIR分别为66.7%、1.2%（P<0.001）；MRDco（+）、MRDco（－）组2年CIR分别为23.0%、1.6%（P=0.004）（图1）。移植后WT1、FCM、MRDco预测复发的敏感性均为66.7%，特异性分别为59.0%、96.4%、74.7%。
FCM：流式细胞术；MRD：微小残留病
FCM（+）与MRDco（+）组均未发生移植相关死亡。FCM（+）、FCM（－）组的2年DFS率分别为33.3%、87.7%（P<0.001），WT1（+）、WT1（－）组2年DFS分别为78.9%、77.8%（P>0.05），MRDco（+）、MRDco（－）组的2年DFS率分别为77.0%、78.9%（P>0.05）；WT1（+）、WT1（－）组2年OS率分别为86.6%、76.3%（P>0.05），MRDco（+）、MRDco（－）组2年OS率分别为88.7%、77.8%（P>0.05）。
27例移植后出现MRDco阳性的患者中，18例接受不同类型的干预，最终5例（27.8%）复发。化疗+DLI干预7例，MRD转阴4例，复发3例；干扰素治疗9例，6例MRD转阴，2例MRD未转阴未复发，1例复发；仅接受化疗1例，MRD转阴；减停免疫抑制剂1例，MRD未转阴而复发。9例患者未接受上述干预，其中7例为连续2次WT1阳性但WT1表达均<1.5%），5例MRD转阴，2例未转阴未复发，另2例为同一骨髓标本WT1和FCM同时阳性，放弃干预并死于复发。
对移植后复发进行单因素分析，结果发现仅移植后FCM（+）（P<0.001）、MRDco（+）（P=0.017）与移植后复发相关（表2）。因本研究入组病例中随访期内复发人数较少，故未进行多因素分析。
影响骨髓增生异常综合征（MDS）患者移植后复发的单因素分析（例）
影响骨髓增生异常综合征（MDS）患者移植后复发的单因素分析（例）
| 因素 | 未复发（83例） | 复发（9例） | 统计量 | P值 |
|---|---|---|---|---|
| 年龄（<38岁/≥38岁） | 43/40 | 3/6 | 1.108 | 0.485 |
| 诊断距移植时间（<5个月/≥5个月） | 44 /39 | 5/4 | 1.697 | 1 |
| MDS分类（RCMD/RAEB-1/RAEB-2） | 12/26/45 | 0/1/8 | 4.126 | 0.127 |
| WPSS分型积分（高危/极高危） | 18/65 | 1/8 | 0.268 | 0.679 |
| 移植前化疗（化疗/未化疗） | 57/26 | 4/5 | 2.134 | 0.159 |
| 移植前状态（CR/未CR） | 26/57 | 1/8 | 2.164 | 0.274 |
| HLA不合位点（相合/不合） | 30/53 | 2/7 | 2.205 | 0.488 |
| 血型不合程度（相合/主要不合/次要不合/主要不合+次要不合） | 48/14/12/9 | 6/2/0/1 | 1.544 | 0.672 |
| 移植前WT1水平（低于中位值/高于中位值） | 43/40 | 3/6 | 1.786 | 0.485 |
| 移植前FCM水平（低于中位值/高于中位值） | 37/46 | 2/7 | 2.026 | 0.433 |
| 移植后WT1（－/+） | 49/34 | 3/6 | 2.183 | 0.17 |
| 移植后FCM（－/+） | 3/80 | 3/6 | 36.585 | <0.001 |
| 移植后MRDco（－/+） | 62/21 | 3/6 | 6.700 | 0.017 |
注：WPSS：WHO预后积分系统；RCMD：难治性血小板减少伴多系发育异常；RAEB：难治性贫血伴原始细胞增多；CR：完全缓解。FCM：流式细胞术；MRD：微小残留病。MRDco阳性：连续2次（间隔2周）WT1≥0.6%或连续2次（间隔2周）FCM阳性或同一骨髓标本WT1≥0.6%且FCM阳性
MDS是一种异质性很强的血液系统克隆性疾病[9]，随着新一代DNA测序技术的发展，近80%的患者可以找到体细胞遗传性突变[10]，其中TP53、RUNX1、ETV6、EZH2、ASXL1及SRSF2等基因已被证实对MDS有重要的预后意义[11]。但目前为止，可用于MDS患者MRD监测的指标尚未明确。allo-HSCT是MDS有效的根治手段，MDS与急性髓性白血病（AML）的生物学发病机制不同，在移植前>60%的MDS患者未接受过化疗，因此在移植后MDS和AML的MRD监测也不尽相同。由于MDS缺乏特异性融合基因，人们越来越关注泛白血病的过表达基因WT1与FCM在MDS患者MRD监测中的意义。
本中心以往研究结果证实WT1基因和FCM是预测包括MDS在内的髓系恶性肿瘤移植后复发的有效指标[5]，但该研究MDS患者仅占11%，未进行亚组分析。此外，MDS的免疫残留和AML表型也存在一定差异，因此本研究仅针对MDS的移植患者进行了分析。结果提示移植后FCM阳性和MRDco阳性与疾病复发明显相关，而移植后WT1阳性与复发虽有相关的趋势，但缺乏统计学意义。
近年来，尽管FCM在MDS诊断及预后中的地位得到逐步认可[12]，并已在NCCN指南中被推荐使用，但目前尚无研究明确FCM作为MDS患者移植后MRD监测指标的预测价值。本研究结果初次证实应用8色FCM结合MDS特有的抗体组合监测MRD对MDS移植后的复发有较好的敏感性和特异性，比单独WT1预测复发更有意义，这与在AML中的结果有所不同，提示这种MDS抗体组合监测MDS患者MRD的有效性。Yoon等[13]对82例接受allo-HSCT的MDS患者进行回顾性分析，显示移植后1个月WT1水平升高对预测复发具有重要意义。但这项研究中约60%的患者是减低预处理，而本研究所有患者均为清髓性预处理。移植后早期的WT1水平不仅反映了MDS的克隆数量，也在一定程度上反映了MDS克隆对化疗药物的敏感性，因此应与预处理强度密切相关。这可能是本研究中移植后WT1水平与复发未显示出统计学相关性的原因之一。另一种可能是由于本研究中复发病例相对较少，可能影响到移植后WT1预测复发的敏感性和特异性。
本中心以往研究证实移植后WT1和FCM形成的组合诊断指标MRDco预测急性白血病患者移植后复发有较好的敏感性且不降低特异性[4]。但该研究未包括因达到MRDco阳性而实施有效干预的患者。而本研究中18例达到MRDco阳性的患者接受了不同类型的干预，干预后仅有27.8%的患者复发，明显低于未接受化疗+DLI干预人群的复发率[5]，这可能是导致本研究中MRDco预测复发的特异性略低于移植后FCM的主要原因。此外，在未接收任何干预的9例患者中，7例仅为连续两次WT1低水平阳性，均未复发，而同时满足WT1和FCM阳性的2例患者最终均血液学复发，也在一定程度上提示移植后FCM是预测MDS复发更为准确的MRD指标。
本研究结果还显示移植前MDS患者的WT1水平及FCM水平与移植后复发无相关性，与移植后WT1和FCM的阳性率也无明显相关性。这可能与本研究中患者均接受的是强度较大的清髓预处理有关。Festuccia等[14]的研究结果表明移植前对FCM及细胞遗传学检出的微小可识别疾病（minimal identifiable disease, MID）阳性人群进行减低强度预处理后，导致死亡的主要原因为疾病复发，他们认为高强度预处理可以克服MID对移植后复发的影响。
综上所述，本研究对WT1和FCM监测MDS独立人群移植后MRD的临床意义进行了分析。结果提示FCM和基于WT1/FCM的MRDco可作为MDS患者MRD监测的有效指标，基于MRDco标准进行复发的干预可降低移植后复发率。
