探讨硫酸寡糖复合物(PI-88)对结肠癌SW620细胞迁移与侵袭的影响及机制。
培养人结肠癌SW620细胞，分为对照组、溶媒组和药物组；对照组细胞不做任何处理，药物组细胞给予5 μL的0.5 mol/L的PI-88，溶媒组给予细胞5 μL的磷酸盐缓冲液(PBS)。各组细胞处理后继续培养24 h，采用划痕实验检测结肠癌SW620细胞迁移距离；Transwell小室检测结肠癌SW620细胞迁移数量与侵袭数量；Western blot检测结肠癌SW620细胞中乙酰肝素酶(HPA)、血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)蛋白的表达。
划痕实验结果显示，药物组SW620细胞迁移距离(35.49±6.89)μm小于对照组(216.75±21.43)μm、溶媒组(227.52±17.72)μm，差异均有统计学意义(P值均<0.05)。Transwell小室细胞迁移、侵袭实验结果显示，药物组SW620细胞迁移数目(226±37)个和侵袭数目(89±11)个均少于对照组(875±93、321±28)个和溶媒组(843±116、331±43)个，差异均有统计学意义(P值均<0.05)。Western blot实验结果显示，药物组PHA、VEGF、bFGF蛋白相对表达量均明显低于对照组和溶媒组，差异均有统计学意义(P值均<0.05)。
PI-88具有抑制结肠癌SW620细胞迁移与侵袭的作用，其作用机制可能与PI-88抑制结肠癌SW620细胞HPA、VEGF、bFGF蛋白的表达有关。
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结肠癌是常见的消化系统恶性肿瘤之一，且近年来其发病率和病死率呈快速上升趋势[1]。结肠癌因起病隐匿，大多数患者确诊时已为中晚期，此时癌细胞极易发生侵袭、转移，手术难以根除；同时，传统化疗药物治疗易出现耐药性[2,3]，临床疗效不理想。目前，结肠癌侵袭、转移机制尚未明确，因此，寻找新的抑制结肠癌侵袭、转移的治疗策略逐渐成为当前的研究热点之一。硫酸寡糖复合物(sulfated oligosaccharide phosphomannopentaose sulfate, PI-88)具有较强的抗肿瘤转移的作用[4]，并且已经进行了包含黑素瘤、非小细胞肺癌、前列腺癌、肝癌等多种肿瘤的Ⅱ期临床试验[5,6,7,8]；但目前关于PI-88应用于结肠癌的研究尚少。因此，本研究以人结肠癌细胞为研究对象，探讨PI-88对结肠癌细胞侵袭转移的影响及其分子机制，以期为PI-88应用于结肠癌治疗提供实验理论依据。
人结肠癌细胞SW620购于中国典型培养物保藏中心；胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)购于浙江天杭生物公司；RPMI 1640培养基购于上海经科化学公司；RIPA裂解液和5×上样缓冲液购于江苏碧云天生物公司；人工基底膜胶购于美国BD公司；PI-88购于澳大利亚Progen生物制药公司；细胞计数试剂盒(cell counting kit-8, CCK-8)、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid, BCA)蛋白定量试剂盒购于广州赖德生物公司；24孔Transwell培养板(8 μm微孔滤膜)购于美国Corning公司；乙酰肝素酶(heparanase, HPA)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)抗体均购于美国Santa Cruz公司；辣根过氧化物(horseradish peroxidase, HRP)标记的IgG抗体购于江苏碧云天生物公司。Mini-PROTEAN Tetra型垂直电泳仪购于美国Bio-Rad公司；Infinite F50型酶标仪购于瑞士Tecan公司；BX51型正置荧光显微镜、活细胞工作站购自日本Olympus公司。
取人结肠癌细胞SW620，37 ℃水浴并剧烈震荡冻存管，待冻存液完全溶解后，加含有10% FBS的RPMI 1640培养基5 mL并接种细胞于培养瓶中，于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养。待细胞贴壁后，吸除含有冻存液的培养基，磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution，PBS)冲洗2遍，加入6 mL含有10% FBS的RPMI 1640培养基继续培养。待细胞铺满培养瓶后，加入0.2%胰酶0.5 mL，待细胞变圆后，吸除胰酶，加入含有10% FBS的RPMI 1640培养基1 mL终止消化，小心吹打数次，吸取含有细胞的培养基，按照1∶4传代培养。
取对数生长期的SW620细胞，用0.2%胰酶消化细胞后，37 ℃、600×g离心5 min，收集细胞。细胞用含有10% FBS的RPMI 1640培养基调整浓度为2×104/mL，接种于6孔板，每孔5 mL。分为对照组、溶媒组和药物组，每组4个复孔。将6孔板置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养6 h，细胞贴壁后分别给予以下处理：对照组不做任何处理；药物组根据预实验加入5 μL 0.5 mol/L的PI-88母液，使得处理细胞的终浓度为50 μmol/L；溶媒组加入5 μL的PBS。各组细胞处理后继续培养24 h用于后续实验。
取处理后培养24 h的对照组、溶媒组和药物组SW620细胞，以0.2%胰酶消化后，37 ℃、600×g离心5 min，收集细胞。用含有10% FBS的RPMI 1640培养基调整浓度为2×104/mL，重新接种于6孔板，每孔5 mL。将6孔板置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养至细胞完全融合后，吸除培养基，用10 μL移液枪枪头垂直在细胞培养板壁上划出一道细痕，用PBS将划下的细胞冲洗3次，加入5 mL含有10% FBS的RPMI 1640培养基于活细胞工作站自带37 ℃、5% CO2细胞培养箱中继续培养24 h，利用活细胞工作站观察细胞迁移轨迹。细胞划痕后和细胞继续培养24 h后均采用活细胞工作站自带拍照系统拍照，并运用美国Media Cybernetics公司Image Pro-Plus 6.0软件分析细胞迁移距离。实验重复3次，结果取平均值。
取处理后对照组、溶媒组和药物组SW620细胞，以0.2%胰酶消化后，37 ℃、600×g离心5 min，收集细胞。细胞用无血清RPMI 1640培养基调整浓度为2×104/mL。在Transwell上室加入400 μL细胞悬液，下室加入700 μL含有10% FBS的RPMI 1640培养基。于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中孵育24 h后，吸除上室液体，擦去上室未穿过膜的细胞，PBS漂洗2次，无水甲醇固定30 min，0.1%结晶紫染色10 min，显微镜随机选取6个视野观察并拍照，所得图片运用Image J软件分析迁移细胞数目。实验重复3次，结果取平均值。
Transwell小室的上室先铺人工基底膜胶，其他步骤与Transwell小室细胞迁移能力检测方法相同。显微镜随机选取6个视野观察并拍照，所得图片运用Image J软件分析侵袭细胞数目。实验重复3次，结果取平均值。
取处理后对照组、溶媒组和药物组SW620细胞，加入RIPA裂解液冰上裂解30 min，4 ℃、12 000×g离心12 min，收集蛋白上清液，用BCA蛋白定量试剂盒检测提取蛋白的浓度。每样品取30 μg蛋白和5×溴酚蓝上样缓冲液按照4∶1的比例混合，在100 ℃煮沸变性5 min。变性后的样品加入8% SDS-PAGE进行电泳。120 V电压电泳80 min，观察溴酚蓝进入分离胶底端时，终止电泳。200 mA电流转至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride, PVDF)膜80 min，PVDF膜经5%脱脂奶粉封闭45 min。各组分别加入HPA(1∶2 000稀释)、VEGF(1∶3 000稀释)、bFGF(1∶2 000稀释)、GAPDH(1∶5 000稀释)抗体室温孵育2 h，缓冲液TBST洗PVDF膜3次，每次5 min，加入1∶2 000稀释的HRP标记的IgG抗体室温孵育1 h，TBST洗PVDF膜3次，每次10 min，暗室电化学显影，Image J软件扫描灰度值分析。以GAPDH为内参计算各组蛋白的相对表达量。实验重复3次，结果取平均值。
目的蛋白相对表达量＝目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值
应用SPSS 19.0统计软件处理数据，服从正态分布的计量资料以
±s表示，采用单因素方差分析，组间两两比较采用Bonferroni校正的t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
划痕实验和Transwell小室检测细胞迁移、侵袭能力实验结果显示，药物组SW620细胞迁移距离、迁移数目和侵袭数目均少于对照组和溶媒组，差异均有统计学意义(P值均<0.05)；而对照组和溶媒组间SW620细胞迁移距离、迁移数目和侵袭数目比较，差异均无统计学差异(P值均>0.05) 。见表1、图1，图2，图3，图4。
PI-88对各组SW620细胞迁移、侵袭能力 影响的比较( 
±s)
PI-88对各组SW620细胞迁移、侵袭能力 影响的比较( ±s)
| 组别 | 样本数 | 划痕实验迁移距离(μm) | Transwell小室检测 | |
|---|---|---|---|---|
| 细胞迁移数目(个) | 细胞侵袭数目(个) | |||
| 对照组 | 3 | 216.75±21.43 | 875± 93 | 312±28 |
| 溶媒组 | 3 | 227.52±17.72 | 843±116 | 331±43 |
| 药物组 | 3 | 35.49± 6.89ab | 226± 37ab | 89±11ab |
| F值 | 127.657 | 51.307 | 315.432 | |
| P值 | <0.01 | <0.01 | <0.01 | |
注：PI-88为硫酸寡糖复合物；对照组比较，aP<0.05；与溶媒组比较，bP<0.05
Western blot检测结果显示，药物组PHA、VEGF、bFGF蛋白相对表达量均低于对照组和溶媒组，差异均有统计学意义(P值均<0.05)；而对照组和溶媒组间HPA、VEGF、bFGF蛋白相对表达量比较，差异均无统计学差异(P值均>0.05) 。见表2、图5。
各组SW620细胞HPA、VEGF、bFGF蛋白相对表达水平的比较( 
±s)
各组SW620细胞HPA、VEGF、bFGF蛋白相对表达水平的比较( ±s)
| 组别 | 样本数 | HPA | VEGF | bFGF |
|---|---|---|---|---|
| 对照组 | 3 | 0.73±0.05 | 0.64±0.08 | 1.29±0.15 |
| 溶媒组 | 3 | 0.79±0.09 | 0.68±0.06 | 1.22±0.11 |
| 药物组 | 3 | 0.06±0.03ab | 0.09±0.03ab | 0.21±0.02ab |
| F值 | 128.530 | 89.750 | 93.920 | |
| P值 | <0.01 | <0.01 | <0.01 |
注：HPA为乙酰肝素酶；VEGF为血管内皮生长因子；bFGF为碱性成纤维细胞生长因子；与对照组比较，aP<0.05；与溶媒组比较，bP<0.05
迁移与侵袭是恶性肿瘤细胞的重要特征，也是导致恶性肿瘤患者病死的主要原因之一。肿瘤细胞侵袭和迁移的关键步骤之一是跨越细胞外基质和基膜组成的屏障[9]。硫酸乙酰肝素多糖(heparin sulphate proteoglycans，HPSGs)是细胞外基质和基膜构成的重要成分[9,10]，而HPA是目前发现的唯一可以降解HPSGs的酶[10,11]。众多研究发现，HPA在多种癌细胞过表达，且与细胞侵袭、转移、血管生成相关[12,13,14,15]。如幽门螺旋杆菌通过促进HPA表达，进而促进胃癌转移[13]；基因沉默HPA表达，能明显抑制胆囊癌细胞侵袭与迁移[14]。PI-88是目前唯一获得美国食品药物管理局人体试验许可的针对HPA的靶向抑制剂，具有较强的抗肿瘤转移及抗肿瘤微血管生成作用[1,4]，已完成临床Ⅰ期实验[16]。本研究预实验发现，SW620细胞中HPA高表达，用PI-88处理结肠癌SW620细胞后，HPA表达受到抑制；采用PI-88处理结肠癌SW620细胞，观察PI-88对结肠癌SW620细胞侵袭与迁移的影响；结果显示PI-88能显著抑制结肠癌SW620细胞迁移与侵袭能力。
众多研究发现，VEGF和bFGF在肿瘤细胞高表达，用VEGF和bFGF刺激肿瘤细胞后，肿瘤细胞侵袭与转移能力增强；抑制VEGF和bFGF的表达，肿瘤细胞侵袭和转移能力降低[17,18]。研究发现HPSGs的硫酸乙酰肝素侧链具有结合bFGF、VEGF等生长因子的能力[19]。HPA主要通过切断HPSGs的硫酸乙酰肝素侧链，降解HPSGs，并且能释放和活化HPSGs结合型的bFGF、VEGF等生长因子，诱导血管生成，从而促进肿瘤细胞的侵袭和转移。已有直接的证据显示，PI-88能有效地阻断了硫酸乙酰肝素侧链的两个硫酸化位点的活性，阻滞结合型血管生成因子的释放与活化[15]。本研究结果显示，PI-88抑制结肠癌SW620细胞bFGF和VEGF的表达，提示PI-88对SW620细胞的抑制作用可能与其抑制VEGF、bFGF蛋白的表达有关。
综上所述，PI-88能抑制结肠癌SW620细胞的侵袭、迁移，其机制可能与PI-88抑制PHA、VEGF、bFGF蛋白的表达有关。本研究的结果为临床应用PI-88治疗结肠癌提供了理论依据。但本研究也存在不足之处，在实验中只观察了PI-88对结肠癌SW620细胞侵袭与迁移的影响，并未研究PI-88对结肠癌细胞其他恶性生物学行为，如增殖、凋亡、血管新生等的影响，存在一定的局限性，后续研究会进一步深入探索结肠癌细胞其他恶性生物学行为及其影响机制。
