罕见病病种多样，大部分症状严重、复杂且具有非特异性，难于诊断和治疗。在基因组医学时代，随着下一代测序技术的广泛应用和基因治疗的深入研究，罕见病的诊治迎来了新转机。下一代测序技术通过高通量检测，辅助临床高效进行表型评估和疾病诊断，推动罕见病发病机制和治疗手段的研究；基因治疗技术不断完善，新药不断获批上市，为罕见病患者带来治愈的希望。本文将对罕见病诊断和治疗在基因组医学时代的进步和挑战进行简要综述。
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罕见病，即发病率极低的一大类疾病。其定义在世界上尚无一致的认定标准，各国主要通过患病人数或发病率来定义罕见病，在美国《孤儿药法案》中定义为少于200 000人罹患的疾病，在欧洲被定义为发病率低于1/2 000的疾病[1]。我国对罕见病暂无明确的立法规定，2018年5月，国家卫健委等五部联合制定了《第一批罕见病目录》，其中包含121种罕见病，为我国罕见病管理工作提供了有力的依据[2]。此前，中华医学会遗传学分会组织的中国罕见病定义专家研讨会认为患病率低于1/500 000或新生儿发病率低于1/10 000的疾病可以称为中国的罕见病[3]。尽管罕见病单个病种发病率很低，但由于病种多，且我国人口基数大，罕见病在我国有着庞大的患病人群，因此，提高罕见病的诊治水平刻不容缓[4]。
目前约有7 000余种罕见病，其中80%为遗传性罕见病[5,6]。导致遗传性罕见病发生的基因变异可累及单个碱基乃至整条染色体。在基因组医学时代，罕见病的诊治迎来了新的转机，下一代测序技术(next generation sequencing, NGS)通过对个体全基因组进行高通量测序，发现可能致病的突变，使表型评估和疾病诊断更有指向性和系统性，大大加快罕见病的诊疗进程，同时也为临床治疗提供指导意见，并且推动疾病发病机制的研究，促进新致病基因的发现。与此同时，孤儿药的加速研发，基因治疗、干细胞治疗等技术蓬勃发展，更是为罕见病治疗带来了新希望。本篇综述将围绕基因组医学时代下，罕见病的分子诊断以及治疗手段的发展，重点讲述NGS和基因治疗的进步与挑战。
经典的基因检测技术主要分为高分辨率的单个基因检测和低分辨率的全基因组检测[7]。前者是基于患者临床表型的特征，对所选择检测的单个基因进行Sanger测序或通过基因分型技术分析，如限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)、多重连接依赖的探针扩增(multiple ligation-dependent probe amplification, MLPA)、荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)等。而后者主要包括G显带核型分析和基因芯片，其中细胞遗传学方法G显带核型分析(分辨率约5～7 Mb)，多用于检测常见的三倍体、节段非整倍体以及大范围的染色体结构异常等。相对而言，累及范围较小的拷贝数变异则可通过基因芯片检测出来，分辨率约50～100 kb，可以检测基因组范围内任何位置的拷贝数变异，包括微缺失和(或)微重复综合征等的致病变异[8]。高分辨率的单个基因检测能否准确诊断疾病，关键在于是否依据临床表型正确地得出了需要检测的基因以及所选择的检测方法，因此适用于临床特征明显且仅有1个或少量几个致病基因的罕见病，如杜氏肌营养不良及其致病基因肌营养不良蛋白(dystrophin, DMD)基因的检测、囊包性纤维症及其致病基因囊性纤维化跨膜传导调节物(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator, CFTR)基因的检测等，都非常适用于这种方法[9,10]。但罕见病表型复杂、遗传异质性强，仅通过表型判断难以准确选择疑似致病基因以待检查。低分辨率的单个基因检测是从细胞水平检测整个基因组，但不能精确到单个基因的具体碱基序列，不能用于诊断由单个碱基的替换、缺失或重复导致的罕见病。据统计，仅有约10%的罕见病患者可通过经典的基因检测技术获得诊断[11]。
NGS又称高通量测序技术，可同时对几十万到几百万条DNA分子进行测序。NGS对待查基因准确选择的依赖度大大减少，使罕见病诊断不再过多受限于临床经验以及疾病症状的非特异性，并且NGS能够获得所测DNA分子的碱基序列，较之于前述的低分辨率全基因组检测，可称为高分辨率的全基因组检测，突破了经典基因检测技术诊断罕见病存在的困境。
在临床实际应用中，基于检测内容大小及类型的不同又可以分为基因包、临床外显子、全外显子组和全基因组检测[12]。基因包检测通过在尽可能纳入与特定表型直接相关的、具有特异性的基因和尽可能多地包括相关表型有关基因之间取得平衡，并且随着文献报道的增多而不断更新，应用于临床表型有特异性但遗传异质性亦强的疾病，以达到鉴别诊断的目的。临床外显子检测对约4 000个已知单基因遗传病的导致基因的全部外显子测序[12]。但实际应用中由于同源基因鉴别困难且需要选择适宜的覆盖度，存在无法准确捕获序列并测序的情况。全外显子组检测覆盖了人类基因组所有的编码序列，全基因组检测则对整个基因组测序。
NGS凭借其高通量、单碱基成本低等特点迅速跻身临床罕见病诊断应用第一线，作为遗传性罕见病分子诊断最重要的检测方法之一，NGS具有许多优势。首先，NGS可在基因组范围内进行高分辨率测序，可为涉及多个致病基因的罕见病诊断提供方便，例如Bardet-Biedl综合征目前已发现了20余个致病基因，而NGS可以1次检测全部疑似致病基因，高效而又精确[13]。其次，NGS具有很高的灵敏度，尤其适用于检测具有组织表达差异性的嵌合体变异[14,15]。与此同时，NGS的应用大大提高了罕见病的诊断率，更能够为疾病的临床治疗提供指导性建议。最后，NGS不断推动了新致病基因的发现，比起2010年刚投入应用，2012年当年所发现的罕见病新致病基因数量就增加了约7倍，2017年在线人类孟德尔遗传数据库(OMIM)中发病机制明确的罕见病总数是2007年的2倍，足见NGS极大地推动了罕见病的机制研究[16]。
目前，没有任何一种分子诊断技术能够检测所有遗传性罕见病，NGS也存在一些不足，其测序读长较短，不适用于三联体重复引起的疾病如脆性X综合征，不适用于检测小范围拷贝数变异包括外显子微缺失、微重复等导致的疾病如杜氏肌营养不良、脊髓性肌萎缩症Ⅰ型等[17,18,19]。另外，当覆盖度较低时要充分考虑到是否可能存在嵌合体变异等情况[20]。NGS在检测拷贝数变异上也有应用前景，但其可靠度仍然落后于基因芯片，故暂不能取代[21]。检测的规模愈大，产生的数据亦愈多，使得测序结果的存储成为一大难题，并且关于数据共享、查看权限等规则都尚未有所定论。随着应用不断推广，NGS在逐渐深入到临床实践过程中也面临着诸多挑战。
NGS的数据分析是目前遗传性罕见病分子诊断的主要挑战。测序结果的解读流程主要为参照人群基因组背景过滤常见变异，并结合详细的临床证据，依据统一原则进行较为合理的致病性评估。目前标准化的分析流程尚未能建立，每个步骤都需结合个体情况具体分析[22]。数据分析效果与原始数据的质量、所采用的算法及软件和人群数据库的规模有关。测序覆盖度是影响变异检出率最关键的质量控制参数，过低的覆盖度将极有可能导致漏检，因此需要依据不同检测项目需求选择合适的覆盖度。
变异解读的过程就是对NGS报告的变异是否为致病变异的判断过程。变异的临床解读是一项持续性的工作，是基于同期文献报道情况的，一些基因可能由于其与疾病关系未知而被遗漏，过去报道的变异也有可能并非真正的致病变异。因此，对已有测序结果的重分析十分必要。变异解读需要统一的评估原则。2015年美国医学遗传学和基因组学学会和美国分子病理学学会发布测序所得变异的致病性分析指南，使得变异的临床解读有了统一的分级和判断流程，临床意义分级包括致病性、可能致病性、临床意义不明、可能良性和良性[23]。对于诊断性检测，需结合临床表型，分析患者的症状是否与变异表型一致或能为该变异所解释，来判断变异是否报告；对于预测性检测，如产检诊断，要分析界定可报和不可报的基因及变异种类。对于检测目的之外的意外发现，依据测试前遗传咨询的结果，按患者及家属选择决定。NGS检测规模大，报告的大量变异数据为正确的解读增加了难度，核心家系(Trio)检测，即对先证者和父母均进行检测，能够提高疾病诊断的效率和准确度[22,24]。
遗传咨询指帮助人们理解遗传因素对于疾病的医学、心理学和家族性等方面影响的过程[25]。基因检测项目的选择，NGS检测出的意义不明变异或显性遗传病新发变异的解读，以及罕见病的治疗办法等都是遗传咨询时需要关注的问题。基因检测项目花费多、种类多，在遗传咨询时需与患者及家属充分沟通，基于患者实际情况进行客观选择[26]。由于变异解读存在时效性，对于意义不明的变异需定期查询数据库及文献报道，必要时开展功能实验作为变异致病性判断的依据。而显性遗传病的新发变异是否来自亲代的生殖腺嵌合体对于下一代的再发风险评估有重要意义，但目前尚无技术标准。罕见病的治疗是患者及家属最为关注的问题，目前仅有一小部分罕见病能够有效进行临床干预，例如苯丙酮尿症患者主要通过饮食疗法进行治疗，法布雷病采取酶替代治疗(enzyme replacement treatment, ERT)清除贮积物以达到干预目的等[27,28]。大部分罕见病患者仍需进行对症治疗、康复训练以及心理干预等来改善病情。
NGS检测在后续分析及评估过程中很大程度上依赖患者临床表型与基因相关性，因此，临床医生全面收集表型并且以术语规范化描述是罕见病基因诊断和资源共享的基础。关于罕见病基因-表型相关性的信息可以从OMIM、Orphanet、Pubmed等数据库获得。美国形态学要素协作组、国际人类表型标准用语联盟(HPO)等组织都为人类体表畸形、疾病异常表型描述的标准化术语提供了规范[29]。
NGS的出现大大提高了罕见病诊断率，使罕见病获得更多关注，相关治疗研究蓬勃发展，然而罕见病的治疗手段还不能满足大部分患者的需求。但在NGS的支持下，罕见病相关治疗研究变得更深入且更具有指向性。
目前，罕见病的治疗手段主要包括对症支持治疗、饮食治疗、药物治疗等。
基因组医学时代分子诊断技术的发展推动罕见病研究，为罕见病药物的研制注入了新的活力，尤其推动了罕见病新分子实体的研究。罕见病新分子实体主要包括蛋白质类药物、小分子类药物、寡核苷酸药物、基因治疗药物等。国际市场上已经推出多种罕见病的治疗药物，例如治疗法布雷病的β-半乳糖苷酶A和α-半乳糖苷酶A、治疗戈谢病的伊米甘酶等[30]。但这些药物大部分需要终生持续性治疗，而基因医学组时代备受关注的基因治疗则为罕见病提供了潜在的治愈方案。
基因治疗，即对基因缺陷所致疾病通过将目的基因导入，对该基因进行替代、补偿及修复以达到治疗目的。基因治疗按照治疗方式可分为体内基因治疗(in vivo gene therapy)和体外基因治疗(ex vivo gene therapy)，前者指直接向血液或目标器官注射携带有所需基因的载体，后者指对从患者体内移出的细胞进行体外改造后重新输入患者体内。基因治疗主要有以下几种策略：(1)将正确基因导入细胞替代或补偿错误(突变)基因；(2)阻断或下调致病基因表达；(3)直接修复错误基因；(4)在体外通过基因工程技术修改细胞，再把修改的细胞放回人体发挥作用，如嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy, CAR-T)激活机体免疫系统[31]。
目前有2种病毒载体平台被普遍认可，即用于体内基因治疗的腺相关病毒(adeno-associated virus, AAV)和用于涉及造血干细胞改造、CAR-T技术等体外基因治疗的慢病毒。随着基因编辑技术的发展，锌指核酸酶(zinc-finger nucleases, ZFNS)、转录激活子样效应因子核酸酶技术(transcription activator-like effector nucleases, TALENS)以及成簇规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)编辑系统等可实现在DNA水平的阻断，进行原位基因修复[30]。基因替代或补偿主要用于隐性遗传病的治疗，尤其是酶缺陷所致罕见病，只需替换1%～5%的细胞内酶活性即可获得所需疗效，这种策略也适用于血友病。而显性遗传病则需要在补偿基因正常功能同时，阻断致病基因的表达[30]。
基因治疗在目前尤其针对单基因罕见病，通过纠正基因缺陷，用1次治疗取代终生持续治疗。2012年，欧洲药品管理局(European Medicines Agency, EMA)首次批准基因治疗药物格利贝拉(glybera)上市，这是一种携带人脂蛋白脂肪酶(lipoprotein lipase)正常基因的AAV1载体，用于治疗脂蛋白脂肪酶缺乏症[32]。2016年EMA批准另一基因治疗药物自体Strimvelis上市，该药利用干细胞基因疗法治疗腺苷脱氨酶缺陷所致重症联合免疫缺陷症(ADA-SCID)[33]。2017年，美国食品和药物管理局(FDA)首次批准治疗罕见遗传性失明的基因治疗药物Luxturna上市，用于治疗视黄酸异构水解酶视网膜色素上皮细胞65(retinoid isomerohydrolase retinal pigment epithelium 65, RPE65)基因缺陷所致遗传性视网膜病变(inherited retinal diseases, IRDs)[34]。
此外，处于领先的罕见病基因治疗药物研究还有BioMarin公司针对血友病A的在研产品BMN270，目前已进入临床三期，将有望用于临床[35]。Novartis公司高额收购的产品AVXS-101，现称为唑基玛(zolgensma)，利用AAV9携带正常运动神经元生存1号(survival of motor neuron 1, SMN1)基因，通过静脉给药治疗SMN1缺陷所致Ⅰ型脊髓性肌肉萎缩症(SMA-Ⅰ型)，目前FDA已受理该生物制剂的上市申请并优先审查[36]。较之于FDA在2016年批准上市的SMA的反义寡核苷酸疗法药物Spinraza，AVXS-101可能会达到更好的治疗效果。
在新技术的支持和政策的鼓励下，各种治疗方法的研发不断加速，基因治疗成为罕见病治疗相关研究的热点之一。目前，基因治疗尚在初期，需要药物审批流程来规范，同时积累临床试验经验。但罕见病种类繁多，患者相对或绝对罕见，要为各种疾病都研制药物似乎难以实现[6,7]。并且随着精准治疗的发展，针对不同突变位点可能也需要设计不同的药物。因此，基因治疗将可能发展为有严格质量标准的治疗方法，而非仅以药物形式发挥作用。
我国罕见病药物研究起步晚，但一直在摸索中不断前进。截至2016年3月16日，在美国上市的商品名孤儿药共计431个，其中172种在我国已获批上市；其中126种可以国产化，较之于2014年明显增加，提示我国罕见病药物研制水平有所提升；仍较为依赖进口的主要是单抗酶类等生物制剂，其对生产工艺要求较高，因此需要我国优化发展生物药产业[37]。虽然目前国内尚无针对某种罕见病的国产原研药上市，但近几年，逐渐有本土药企的研发药物获得美国FDA的孤儿药资格认定，并通过国家药品监督管理局优先审批进入临床试验阶段，说明我国的罕见病药物研发正积极发展，并逐渐与国际接轨。
近年来，国家政策对罕见病愈加重视。2018年5月，五部委联合制定的《第一批罕见病目录》更是大力推动了我国罕见病药物市场的积极发展[2]。目前，我国将部分罕见病用药纳入医保，初步缓解了一部分罕见病患者因药价高昂无法接受治疗的境况，相对促进了罕见病用药的流通，也激发了本土药企的研发热情[38]。随着政府政策支持和激励增加，国内机构涉足罕见病治疗研究，在现今优惠政策下，如能抢占先机，激发基因治疗的经济潜力，我国孤儿药的研发将真正有所突破。
在基因组医学时代，随着长读长测序投入研发、生物信息学优化算法、人群和变异数据库扩充、临床与基因检测紧密配合，NGS检测在罕见病基因诊断中将得到越来越广泛的应用。而孤儿药的研制快速推进，新型疗法的研究不断深入，有效治疗药物获批上市，为罕见病治疗开启了新篇章。随着人们对基因组医学的认识不断加深，罕见病的社会关注度不断提升，相信罕见病患者将会得到更好的医疗服务，并参与社会生活、实现自我价值。
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