本文报道一遗传性凝血因子Ⅶ缺乏症家系及基因分析结果。先证者检测到凝血因子Ⅶ基因发生c.1198 G>C（p.Val400Leu）和IVS6-1 G>A复合杂合突变。前者在中国汉族人群当中尚未见报道。其中c.1198 G>C（p.Val400Leu）突变来自患儿母亲；IVS6-1 G>A来自患儿父亲。IVS6-1 G>A突变为已知致病突变，c.1198 G>C（p.Val400Leu）在100名正常对照人群中未检出该突变。根据美国医学遗传学与基因组学学会（ACMG）遗传变异分类标准与指南，c.1198 G>C突变为可能致病突变。先证者凝血因子Ⅶ基因c.1198 G>C（p.Val400Leu）和IVS6-1 G>A复合杂合突变可能是患儿表现为临床出血症状的遗传学致病因素。
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遗传性凝血因子Ⅶ缺乏症是由于凝血因子Ⅶ基因突变所导致的常染色体隐性出血性疾病，发病率约为1∶500 000。由于凝血因子Ⅶ功能缺陷，影响了机体外源性凝血途径的起始阶段，从而导致临床出血症状。该病在临床上分两种类型：1型表现为凝血因子Ⅶ抗原（FⅦ antigen，FⅦ：Ag）和凝血因子Ⅶ活性（FⅦ activity，FⅦ：C）都降低；2型表现为FⅦ：C降低，但FⅦ：Ag正常[1]。凝血因子FⅦ基因缺陷导致血浆中凝血因子Ⅶ含量减少和（或）功能发生障碍，部分患者可发生出血症状。已报道的凝血因子Ⅶ基因突变类型包括错义或无义突变、剪切位点突变，小的插入、缺失及启动子区域突变等。本文报道一例遗传性凝血因子Ⅶ缺乏症患儿，通过对先证者及其家系成员基因测序，探讨其致病原因。
先证者为男性患儿，4岁，因"反复鼻衄，加重1 d"就诊。患儿出生后有出血部位止血困难病史。入院前1年无明显诱因出现间断鼻出血，量中等，间隔3~5 d。经用云南白药及棉球填塞处理后止血。近期出血间隔时间缩短，出血量多，上述方法不能有效止血。入院前1 d，出血加重，为进一步诊治，收住入院。患儿部分出凝血功能检验指标异常：凝血酶原时间（PT）51.8 s（参考范围：11.0~ 14.0 s，对照值12 s）；活化部分凝血活酶时间（APTT）26.8 s（参考范围：25.0~43.0 s，对照值30 s）；纤维蛋白原（FIB）2.25 g/L（参考范围：2.00~4.00 g/L）；凝血酶时间（TT）17.5 s（参考范围：16.0~18.0 s）；凝血因子Ⅶ活性（FⅦ：C）2.8%（参考范围：50.0~150.0%）。患儿父母上述检测指标均在正常参考范围内。患儿为第一胎，父母体健，非近亲结婚。父母双方家族中否认有异常出血患者。母亲孕期无高危因素暴露病史。在患儿父母知情同意的情况下，抽取患儿及其父母乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝外周静脉血2~4 ml进行DNA提取。选择本实验室100名健康成人DNA做对照样本。
（1）提取DNA及定量：采用北京天根生化科技有限公司外周血基因组提取试剂盒（TIANGEN TIANamp Genomic DNA Kit）按照说明书提取DNA。TE充分溶解，Nano Drop 2000核酸定量仪测定DNA纯度和浓度。DNA浓度控制在50~250 ng/μl，-20℃保存。（2）PCR扩增及电泳：用在线引物设计软件Primer 3自行设计9对引物以覆盖凝血因子Ⅶ基因全部外显子及其侧翼和启动子区，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。PCR反应条件：94℃变性5 min，然后95℃变性30 s，61℃复性30 s，72℃延伸1 min，34个循环后于72℃再延伸10 min。PCR产物1.5%琼脂糖电泳，切胶纯化后，在ABI 9700 PCR仪上进行测序反应；在ABI 3500DX遗传分析仪上进行毛细管电泳。（3）Sanger测序结果分析：应用序列比对软件SeqMan7.1对Sanger测序结果与凝血因子Ⅶ基因参考序列（NM_019616.3）进行比对分析。
Sanger测序结果与凝血因子Ⅶ基因参考序列（NM_019616.3）经比对发现，患儿存在该基因IVS6-1 G>A、c.1198 G>C（p.Val400Leu）复合杂合突变。患儿父亲携带有凝血因子Ⅶ基因IVS6-1 G>A杂合突变；患儿母亲携带有凝血因子Ⅶ基因c.1198 G>C（p.Val400Leu）杂合突变（图1）。检索人类基因突变数据库（Human Gene Mutation Database，HGMD），凝血因子Ⅶ基因IVS6-1 G>A为已知致病突变。凝血因子Ⅶ基因c.1198 G>C（p.Val400Leu）突变类型国内外尚未见报道，100份对照样本未检出此类突变。
注：A示患者外周血标本检测到父源性致病突变IVS6-1 G>A；B示患者外周血标本检测到母源性突变c.1198 G>C
应用突变危害预测软件PolyPhen-2 v2.2.2r398对凝血因子Ⅶ基因c.1198 G>C突变的致病性进行预测分析，结果为"可能危害"（PROBABLY DAMAGING）得分0.998（敏感性0.18，特异性0.98）。根据ACMG遗传变异分类标准与指南，该突变为可能致病突变。
凝血因子Ⅶ是肝脏合成的维生素K依赖性单链糖蛋白酶原。血浆中，凝血因子Ⅶ主要以酶原形式存在，活性形式的凝血因子Ⅶa仅占1%。成熟凝血因子Ⅶ由406氨基酸残基组成，相对分子质量为45 078。凝血因子Ⅶ基因定位于13号染色体13q34，长度为12 800碱基对，由9个外显子和8个内含子组成。外显子2编码γ-羧基谷氨酸（Gla）区；外显子3编码一个小的疏水区；4、5号外显子编码表皮生长因子样区（EGF）；6~8号外显子编码催化区。凝血因子Ⅶ的作用主要是和组织因子（TF）形成复合物（TF·FⅦ）后激活凝血因子X（FX）而启动外源性凝血途径[2]。
凝血因子Ⅶ基因突变是导致凝血因子Ⅶ功能异常，发生临床凝血功能障碍，导致临床出血症状的主要原因。据HGMD（http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php gene=F7）报道，凝血因子Ⅶ基因突变类型包括错义或无义突变、剪切位点突变，小的插入、缺失及启动子区域突变及复杂重排等。其中错义或无义突变约占65%、剪切位点突变约占15%，小的插入、缺失及启动子区域突变占15%，其它突变类型约占5%。凝血因子Ⅶ基因突变与临床表型的关系较为重要，纯合性和复合杂合性基因突变，其凝血因子Ⅶ活性（FⅦ：C）一般在1%~5%之间，多伴有临床症状；而单纯的杂合突变FⅦ：C一般不低于30%，几乎没有什么临床症状，仅有一些特殊的杂合突变可表现为中、轻度的临床出血[3]。本文报道的先证者为凝血因子Ⅶ基因IVS6-1 G>A、c.1198 G>C（p.Val400Leu）复合杂合突变患者。患儿出生后有出血部位止血困难病史。PT 51.8 s（参考范围：11.0~14.0 s，对照值12 s），凝血因子Ⅶ活性（FⅦ：C）2.8%（参考范围：50.0~150.0%）。先证者父母为凝血因子Ⅶ基因IVS6-1 G>A和c.1198 G>C杂合突变携带者，PT、FⅦ：C均在正常参考范围之内，分别为12.1 s和12.7 s、89.3%和91%。先证者父母均无异常出血、出血不止和鼻衄病史，其临床表型与文献报道相符。
有关凝血因子Ⅶ基因IVS6-1 G>A致病突变在中国患者人群中报道较多，可能是中国汉族人的热点突变[4,5]。其分子致病机制可能是由于该突变破坏了GT-AG剪接规则中受体位点的保守序列，使凝血因子Ⅶ基因内含子6不能被正常剪接所致。Yu等[5]对凝血因子Ⅶ基因IVS6-1 G>A突变的致病机制进行体外mRNA转录水平研究。结果表明，突变导致外显子7被跳跃剪接，形成了缺乏7号外显子的异常转录本。因此推测IVS6-1G>A突变后，由于外显子7丢失，从而影响凝血因子Ⅶ蛋白的合成、分泌及生物功能。凝血因子Ⅶ基因c.1198 G>C突变类型，目前国内外文献中尚未见报道。我们对出凝血功能正常的100份健康对照样本进行检测，未发现该突变。应用PolyPhen-2 v2.2.2r398软件对其致病性进行预测分析，PROBABLY DAMAGING得分0.998，为可能致病性突变。根据ACMG遗传变异分类标准与指南，结合患者临床症状，凝血因子Ⅶ基因c.1198 G>C为可能致病性突变。凝血因子Ⅶ基因c.1198 G>C（p.Val400Leu）、IVS6-1 G>A复合杂合突变可能是患者表现为临床出血症状的遗传学致病因素。
遗传性凝血因子Ⅶ缺乏症在临床上以出血症状为主要表现。常见的出血症状为鼻衄、牙龈出血、皮肤瘀点、瘀斑、呕血、黑便及创伤后持续性出血等，严重者发生致命性颅内出血。患者的出血症状与出血程度往往与其FⅦ：C检测水平不一致。丁秋兰等[6]报道了一名由于携带有三种杂合突变的临床出血症患者，其FⅦ：C检测结果仅为1%，而与先证者有相同基因突变的另两位家系成员却无临床症状。Heremann等[3]报道l例凝血因子Ⅶ基因7号内含子短重复序列杂合突变的女性，其FⅦ：C仅为1%，临床表现为月经过多、具有轻度的出血倾向。因此，仅凭FⅦ：C检测无法判断患者病情及愈后。通过基因诊断，可以明确患者基因型，为临床治疗及以后的产前诊断提供帮助。因此，临床遇到FⅦ活性低下的患者时，应当对先证者及其父母凝血因子Ⅶ基因进行Sanger测序，明确是否由于基因突变导致的临床表现。
所有作者均声明不存在利益冲突
