探讨炎症性肠病（IBD）患者小肠上皮细胞中维生素D受体（VDR）的表达水平与自噬流受损之间的相关性。
回顾性收集41例IBD患者和13例正常对照者的小肠黏膜组织，分别设为IBD组和正常对照组。采用免疫组化检测两组小肠上皮细胞自噬流相关标志物（LC3、p62）和VDR蛋白的表达。统计分析VDR和LC3以及p62的相关性。
与正常对照组相比，IBD患者小肠上皮细胞中VDR表达显著下降，而LC3和p62的表达增加（均P<0.0001），提示自噬流受损。VDR的表达与LC3（r=-0.59，P<0.01）和p62（r=-0.62，P<0.01）的表达呈负相关。
IBD患者中VDR表达量的减少可能与自噬流受损有关。
版权归中华医学会所有。
未经授权，不得转载、摘编本刊文章，不得使用本刊的版式设计。
除非特别声明，本刊刊出的所有文章不代表中华医学会和本刊编委会的观点。
炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）患者中存在维生素D缺乏的状况，而维生素D受体（vitamin D receptor，VDR）缺乏与IBD的发病相关[1]。VDR是一种细胞核转录因子，可与配体1，25-二羟基维生素D3[1，25-（OH）2D3]特异性结合调控维生素D的功能[2]。自噬是一种进化上保守的分解代谢机制，通过细胞分解代谢产物、细胞器的降解和再循环维持细胞内稳态[3]。自噬流受损的特征在于LC3和p62（自噬的选择性底物）的积聚。研究报告显示：VDR缺失与体内外自噬调节基因ATG16L水平相关[4]。本研究采用免疫组化的方法探讨IBD患者小肠上皮中VDR的表达与自噬流相关蛋白LC3和p62的关系，并为使用VDR配体1，25-（OH）2D3干预IBD提供理论支持。
回顾性分析2013年1月至2018年12月常州市第一人民医院消化内科确诊的41例IBD患者，设为IBD组。IBD患者纳入标准：临床症状及相应检查结果均符合IBD诊断标准；排除标准：合并严重器质性疾病、肿瘤、精神疾病、意识障碍的患者。IBD诊断标准：IBD的诊断基于传统的临床、内镜特征及病理学诊断标准，并最终通过回肠或者结肠活检的组织学检查得到证实[6]。同期招募正常对照者13例，设为正常对照组，纳入标准：肠道标本来源于因腹泻行肠镜检查，最终考虑功能性腹泻的受试者。本研究获得常州市第一人民医院伦理委员会的批准（批准号：2018科第002号）。
内镜下采用活检钳夹取少量怀疑病变的回肠或结肠组织。
收集患者的一般情况，包括年龄、性别、文化程度、病程、用药情况等。
标本采用4%甲醛固定，石蜡包埋，切片机作3 μm切片。为修复抗原，这些切片再水合，并且使用加热的柠檬酸盐回收抗原，最后进行免疫组织化学染色。一抗：兔抗人VDR（浓度1∶200）、兔抗人LC3（浓度1∶200）和兔抗人p62（浓度1∶200）均购自美国Abcam公司。使用辣根-过氧化物酶耦联的二抗（Vectastain elite ABC试剂盒，美国Vector Labs公司）进行可视化染色，3种蛋白阳性染色均为棕褐色颗粒。每种蛋白至少重复3次实验，并选取× 200代表性图像进行分析，采用Image Pro Plus软件测量目的蛋白积分光密度（IOD）。
使用Graphpad Prism V6.0统计软件，年龄、蛋白质表达等计量资料为正态分布且方差齐性，以（Mean ±SD）表示，组间比较行Student′st检验；性别等计数资料以百分数表示，组间比较行卡方检验。VDR与LC3、p62的相关性行Spearman相关性分析。以P<0.05为差异具有统计学意义。
IBD组41例，男26例，女15例；平均年龄（41.6 ± 8.5）岁；平均病程（43.6 ± 13.7）个月。药物治疗情况：5-氨基水杨酸盐治疗33例（80.4%），糖皮质激素治疗5例，营养治疗1例，余2例未接受药物治疗。正常对照组男8例，女5例；平均年龄（45.2 ± 11.7）岁。两组在性别和年龄上差异均无统计学意义（P<0.05），具有可比性。
正常对照组和IBD组3种蛋白IOD值比较（Mean± SD）
正常对照组和IBD组3种蛋白IOD值比较（Mean± SD）
| 组别 | VDR | LC3 | p62 |
|---|---|---|---|
| 正常对照组（n=13） | 3624.0 ± 1008.0 | 1240.0 ± 481.6 | 1343.0 ± 424.4 |
| IBD组（n=41） | 1415.0 ± 550.0 | 2488.0 ± 765.2 | 2588.0 ± 835.5 |
| t值 | 10.16 | 5.525 | 5.143 |
| P值 | <0.0001 | <0.0001 | <0.0001 |
注：IBD为炎症性肠病；VDR为维生素D受体
正常人群小肠组织中VDR阳性染色主要表达在细胞核，IBD组VDR表达较正常对照组明显减少，差异具有统计学意义（P<0.0001）。
在正常人群小肠组织中，LC3和p62的阳性染色很少，但IBD患者小肠上皮腺体柱状细胞中LC3和p62大量积聚；定量分析发现：IBD组LC3和p62的表达量均明显高于正常对照组（均P<0.0001），提示自噬流受损。
Spearman相关分析表明，IBD组VDR表达与LC3（r=-0.59，P<0.01）和p62（r=-0.62，P<0.01）的表达呈负相关。
IBD是一种胃肠道的慢性特发性炎症性疾病，包括克罗恩病（CD）和溃疡性结肠炎（UC），两者临床表现及治疗方案有较多相似之处。IBD的病因是机体对肠道内细菌抗原产生先天性和适应性免疫反应，导致肠黏膜通透性增强和肠道免疫失调[5]。
维生素D对IBD和结直肠癌免疫系统的调节作用越来越受到关注[6]。研究表明：超过60%的IBD患者维生素D缺乏[7]。根据生态学研究的结果，太阳光紫外线照射可降低IBD的风险[8]。因此，维生素D缺乏和IBD的发生密切相关。另外，IBD患者维生素D的缺乏与VDR基因的多态性有关，缺乏VDR基因的小鼠体内促炎性NF-κB通路可被激活[9]。与之前报道一致[4]，本研究结果显示：与正常对照组比较，IBD患者的小肠上皮细胞VDR水平显著降低（P<0.0001）。这些发现表明：VDR在维持肠道内环境平衡中发挥至关重要的作用。然而，VDR在IBD中的确切分子机制尚不清楚。
自噬与IBD关系密切。自噬是一个吞噬自身细胞质蛋白或细胞器并使其包被进入囊泡，并与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物的过程。自噬与机体的衰老、生长、神经变性、癌症和免疫有关。自噬相关基因如ATG16L1和IGRM的突变与IBD具有相关性。介导天然免疫的胞质蛋白NOD2可招募ATG16L1蛋白诱导自噬的发生[10]。若IBD患者树突状细胞含有NOD2或ATG16L1变异体，那么在自噬诱导、细菌处理和抗原呈递中存在缺陷[11]。这些自噬基因缺陷可导致肠道菌群的异常相互作用，从而引发过度的促炎症反应。
维生素D和自噬都与IBD的发病机制有关[12]，作者进一步研究维生素D与自噬之间的关系。研究表明：VDR可以通过调控Beclin-1、BCL-2、mTOR、细胞内钙离子浓度和溶酶体成熟等环节，通过调节自噬体的起始、成核、成熟等多个过程促进自噬发生[13]。在肠炎动物模型中，VDR缺失导致自噬缺陷是肠炎加重的重要因素[4]。当自噬流被阻断时，LC3和p62的降解会减少，因此根据这两种蛋白质的变化来测量自噬流是一种经典的方法[14]。本研究发现：VDR表达与LC3（r=-0.59，P<0.01）和p62（r=-0.62，P<0.01）的表达呈负相关，说明IBD患者肠道细胞VDR的缺乏与自噬流受损有关。
综上所述，IBD患者中VDR表达量的减少可能与自噬流受损有关，推测肠上皮细胞VDR通过自噬流在肠道内环境平衡中起着调节作用。
所有作者均声明不存在利益冲突
