幽门螺杆菌（H. pylori）感染导致的疾病属于感染性疾病，应该按照感染性疾病的处理原则，通过药敏结果来指导抗菌药物的选择，从而避免因抗菌药物选择不当而导致的治疗失败和耐药菌株的产生。然而，由于H. pylori是一种微需氧菌和苛养菌，其药敏检测方法及耐药折点尚未在全球范围内形成统一共识，目前也尚无全自动化或半自动化的H. pylori药敏检测体系，导致目前绝大多数医院都未开展对H. pylori的常规培养和药敏检测。本文就现有针对H. pylori的不同药敏检测方法、存在的问题以及未来展望作一综述。
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幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,H. pylori）感染可导致慢性胃炎、消化性溃疡、胃恶性肿瘤等消化道疾病，也可导致难治性缺铁性贫血、难治性荨麻疹等消化道外疾病。目前公认H. pylori感染世界范围内44亿人口，是导致胃癌的最主要危险因素[1]。质子泵抑制剂（PPI）加抗菌药物联合使用是根除H. pylori的主要方法。然而，由于抗菌药物的不规范使用，H. pylori对常用抗菌药物的耐药率逐年增高，导致根除率明显下降。在世界卫生组织（WHO）六个区域的几乎所有成员国中，H. pylori对克拉霉素、甲硝唑和左氧氟沙星的耐药率都已超过15 % [2]。如果H. pylori耐药菌株在人群之间广泛传播，势必引发严重的公共卫生问题。H. pylori是一种微需氧菌，体外培养有一定难度，其药敏检测方法及耐药折点尚未形成共识，目前大多数医院都未对其开展常规培养和药敏检测。
H. pylori表型耐药检测方法需要依赖胃镜钳取患者胃黏膜组织（一般为胃窦组织1块、胃体组织1块），将组织匀浆后涂布于血平板，在37 ℃微需氧环境中（5 % O2、10 % CO2、85 % N2）分离培养H. pylori。菌落长成后进行革兰染色、尿素酶试验、过氧化氢酶试验、氧化酶试验等进行鉴定，然后通过以下不同方法检测分离菌株对常用抗菌药物的耐药情况。
美国临床和实验室标准协会（CLSI）推荐琼脂稀释法作为H. pylori对克拉霉素药敏检测的"金标准"，规定耐药折点为最低抑菌浓度（MIC）≥ 1.0 mg/L，敏感折点为MIC ≤ 0.25 mg/L，而MIC=0.5 mg/L为中介（clsi.org/standards/products/microbiology/documents/m45)。除克拉霉素外，CLSI并未推荐琼脂稀释法作为其他几种常用抗H. pylori药物的药敏检测方法，也未推荐相应抗菌药物的耐药折点。
虽然琼脂稀释法可以准确地检测临床分离菌株对常用抗H. pylori药物的MIC值，但该方法需要制备大量不同稀释浓度的抗菌药物平板，操作复杂、费时费力，尤其不适合针对少量临床分离菌株的药敏检测。例如，若只检测一株临床分离菌株对6种抗菌药物的MIC值，按一种抗菌药物配置8种不同稀释浓度的血平板计算，那么在保证操作不失误的情况下就需要消耗48个血平板。因此，琼脂稀释法难以在临床实践中广泛开展。
E-test法通过专用的贴条器或镊子将浓度呈连续指数梯度降低的抗菌药物E-test试纸条贴在接种有待测菌株的培养平板上培养后，根据抑菌环边缘与试纸条交界点的抗菌药物浓度，仅用一个血平板便可测定H. pylori对该种抗菌药物的MIC值，操作流程简单。
研究发现，E-test法检测H. pylori对甲硝唑的MIC值高于琼脂稀释法，因此用E-test法可能会高估临床H. pylori分离株对甲硝唑的耐药率[3,4]。然而，E-test法在H. pylori对阿莫西林、喹诺酮类药物、克拉霉素和四环素的药敏检测中与琼脂稀释法存在较好的一致性[3,4,5]。因此，英国抗菌化疗协会（BSAC）推荐E-test法作为H. pylori对阿莫西林、克拉霉素、左氧氟沙星、四环素、甲硝唑和利福平的药敏检测方法（www.bsac.org.uk）。然而，进口E-test试纸条价格较昂贵，大约40元/条，限制了其在临床推广中的可行性，目前在我国仅作科研所用。虽然国产E-test药敏试纸条价格相对便宜，但其与进口药敏纸条的一致性方面尚需要进一步验证，其抗菌药物种类也需要进一步完善。
纸片扩散法是临床微生物实验室用于细菌药敏检测的经典方法，也是目前使用最为广泛的方法之一[6]。该方法将预先浸有一定浓度的抗菌药物纸片贴在接种有待测菌株的培养平板上培养后，根据抑菌环直径的大小判断受试菌对该抗菌药物的敏感性。
相对于琼脂稀释法和E-test法，纸片扩散法操作最为简单，也是最为经济的药敏检测方法。研究显示，纸片扩散法与琼脂稀释法或E-test法相比在检测H. pylori对克拉霉素、甲硝唑和左氧氟沙星药敏结果具有较好的一致性，药敏纸片耐药抑菌环折点也可以很好地区分临床耐药菌和敏感菌株[7,8,9,10]。例如，根据CLSI推荐的MIC>1.0 mg/L作为克拉霉素耐药折点，Grignon等[7]应用15 μg克拉霉素纸片于含10%马血的Mueller-Hinton琼脂培养基，并接种3.0麦氏浊度[约108菌落形成单位（CFU）/ml]菌量，对191株临床H. pylori分离菌株进行纸片扩散法药敏试验，通过直线回归方法得出对应药敏纸片的抑菌环折点为22 mm，通过该直径判定的克拉霉素药敏结果与E-test MIC折点法一致性达到99.5 %。然而需要指出的是，由于不同实验室在培养基的选择、接种菌量、培养时间和条件以及抑菌环的测量标准尚未统一，以及不同实验室使用不同药量的药敏纸片和参考的MIC耐药折点差异，导致不同实验室得出的克拉霉素、甲硝唑和左氧氟沙星药敏纸片耐药抑菌环折点无法形成统一。例如，以MIC>8.0 mg/L作为甲硝唑耐药折点，利用5 μg的甲硝唑纸片，Xia等[8]使用含7%马血的哥伦比亚琼脂平板，接种菌量为3.0麦氏浊度时，通过直线回归方法得出的抑菌环折点为20 mm；而Midolo等[9]使用含5%马血的Wilkins-Chalgren琼脂平板，接种菌量为1.0麦氏浊度时，通过直线回归方法得出的抑菌环折点为12 mm。Yu等[10]以MIC>1.0 mg/L作为左氧氟沙星耐药折点，使用5 μg左氧氟沙星纸片扩散法与E-test法相比较得出的抑菌环折点为12 mm；而Boyanova等[11]在使用1 μg左氧氟沙星纸片扩散法与E-test法相比较时，得到的抑菌环折点为9 mm。
既往有研究也评估了10 μg阿莫西林纸片和30 μg四环素纸片对临床H. pylori分离菌株的药敏检测[12]。由于对该两种抗菌药物耐药的H. pylori菌株数量较少，以及所观察到的抑菌环直径太大（平均约60 mm），尚不能得出区分H. pylori临床耐药菌株的抑菌环折点。
尽管纸片扩散法经济、操作简便，但目前各实验室方法及判断标准尚未统一，且对阿莫西林、四环素、呋喃唑酮的检测尚无明确的抑菌环折点。因此，本方法尚不适合临床广泛应用。
微量肉汤稀释法也是一种定量的药敏检测法。该方法将倍比稀释后不同浓度的抗菌药物溶液加入微量反应板上进行操作，可一次性检测一例菌株对多种抗菌药物的MIC值，因此极大地提高了药敏检测效率。对于其他临床常见微生物的药敏检测，目前已经有标准化和商业化的微量肉汤稀释药敏检测平板和自动化仪器，使操作更简便，结果更准确[13]。
由于H. pylori是一种微需氧菌和苛养菌，体外液体培养技术要求高，因此目前使用微量肉汤稀释法对H. pylori进行药敏检测的研究相对较少，相关的技术条件也尚未标准化。DeCross等[14]使用含5%胎牛血清的布氏肉汤配制H. pylori的药敏增菌液，并按照每孔200 μl的量加入96孔板中，发现多数菌株在液体条件下培养困难。然而，Hachem等[15]在使用含有10%胎牛血清和0.25%酵母提取物的脑心浸液，按照每孔160 μl的量进行液体培养时，H. pylori生长良好。该研究显示，微量肉汤稀释法与E-test法相比，在检测122例临床H. pylori分离菌株对阿莫西林和克拉霉素药敏结果的一致性较好（MIC值波动范围在一个药物浓度梯度之内的比例分别为90.1%和88.5%）。Sisto等[16]使用含3 %胎牛血清的RPMI-1640细胞培养基，按每孔接种菌量5×105 CFU，对55例临床H. pylori分离菌株进行微量肉汤稀释法药敏检测，同时与琼脂稀释法作为对照，发现两种方法在检测H. pylori对甲硝唑、阿莫西林和克拉霉素药敏结果的一致性依次为100 %、96.3 %和90.7 %。
综上，以上四种表型耐药检测方法都是基于有H. pylori生长基础之上，未来需要完善胃黏膜标本采集、转运和分离/培养的标准化操作流程，使胃黏膜标本H. pylori的培养阳性率达到95%以上。四种不同表型耐药检测方法各有优缺点，但唯有肉汤稀释法有可能实现高通量和全自动化，未来需要进一步优化H. pylori的液体培养、微量肉汤稀释药敏检测平板和自动化检测仪器，用于H. pylori的常规药敏检测。
与传统表型耐药检测方法相比，分子耐药检测方法不需要培养，因此可以在短时间内出具报告，更加方便快捷。目前的研究发现，H. pylori克拉霉素耐药主要由其23S rRNA基因V区的A2142C、A2142G、A2143G突变所导致[17,18]；H. pylori对左氧氟沙星耐药主要由其DNA旋转酶GyrA的Asn-87和Asp-91位点突变所导致[17]。然而，H. pylori对另外几种常用抗菌药物的分子耐药机制尚不清楚。因此，目前分子耐药检测方法仅适用于H. pylori对克拉霉素和喹诺酮类抗菌药物的药敏检测。
目前，H. pylori分子耐药检测的标本主要为胃黏膜组织，检测方法主要基于PCR技术，如实时荧光定量PCR法（RT-PCR）、多重PCR核酸探针杂交法、双启动寡核苷酸引物PCR法（DPO-PCR）、PCR-限制性片段长度多态性分析法（PCR-RFLP）等[19]。另外，随着基因测序技术的推广应用和成本的下降，目的基因测序[20]或二代全基因组测序技术也被逐渐用于H. pylori分子耐药检测[21,22]。
需要指出的是，H. pylori分子耐药检测的标本主要通过胃镜获取，属于有创性检查。近年来通过粪便标本进行无创性的H. pylori分子耐药检测受到关注。然而由于粪便中H. pylori含量较低，而其他杂菌较多以及粪便中食物残渣、胆盐、重金属离子及多糖等物质对23S rRNA和GyrA基因PCR扩增的影响，粪便标本与胃黏膜标本通过GenoType® HelicoDR试剂盒检测H. pylori对克拉霉素和左氧氟沙星药敏结果一致性仅为53%和35%[23]。因此，基于粪便标本的H. pylori分子耐药检测尚需进一步完善。
目前基于培养的H. pylori药敏检测方法和对应抗菌药物的耐药折点缺乏统一标准。国际上H. pylori耐药折点主要参考美国CLSI标准和欧盟药敏试验标准委员会（EUCAST）标准（eucast.org/clinical_breakpoints）。上文已经提到，美国CLSI仅推荐了H. pylori对克拉霉素的耐药折点MIC≥ 1.0 mg/L，而对其他几种常用的抗H. pylori药物的MIC耐药折点并未推荐。EUCAST推荐H. pylori对6种抗菌药物的耐药MIC折点。然而，EUCAST和CLSI推荐的H. pylori对克拉霉素的耐药MIC折点并不一致（分别为0.5和1.0 mg/L）。这主要是因为CLSI标准主要是基于临床经验，其推荐的折点可以理解为临床耐药折点；而EUCAST推荐的耐药折点为"流行病学界值"(epidemiological cut-off value）或称为"微生物学折点"，主要用于区分"野生型"和"非野生型"菌株，而不能用于区分真正的临床敏感菌株和耐药菌株。这使EUCAST标准并未被临床完全采纳，导致H. pylori的耐药折点缺乏统一标准，不同实验室之间存在很大差异。克拉霉素耐药折点除了CLSI和EUCAST推荐的1.0和0.5 mg/L外，还包括其他研究中采用的2.0 mg/L[24]。其他抗生素也存在类似问题，阿莫西林耐药折点除了EUCAST推荐的MIC>0.125 mg/L外，还包括其他研究中采用的多种不同MIC耐药折点：0.5 mg/L[24]、1.0 mg/L[25]、1.5 mg/L[26]、2.0 mg/L[27]以及8.0 mg/L[28]。药物耐药折点不统一，给临床耐药菌株的判断和药物的合理选择带来了极大困扰，需要我们共同努力获得公认的药物耐药折点，便于临床开展实际工作。
综上，H. pylori的表型耐药和分子耐药检测方法各有优缺点。分子耐药检测方法的优点是不需要培养，方便快捷，但其缺点是只能对克拉霉素和左氧氟沙星进行检测，结果和表型耐药检测并不完全相符。另外，目前的分子耐药检测需要依赖胃镜获取胃黏膜组织，也是一种侵入性的检测方法。因此，未来H. pylori分子耐药检测的方向将是进一步优化粪便H. pylori分子耐药检测的敏感性和特异性。
H. pylori表型耐药检测方法是一种侵入性的药敏检测方法，需要等待较长时间。尽管如此，表型耐药检测方法却是目前唯一能对所有抗H. pylori药物进行药敏检测的方法[29]。因此，未来H. pylori药敏检测需要建立标准化和自动化的H. pylori表型耐药检测系统，使H. pylori的常规药敏检测变为可能，从而促进药敏指导H. pylori个体化精准治疗在临床上的广泛开展。
所有作者均声明不存在利益冲突
