目前，采取异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)，是临床上大多数遗传性血液系统疾病和原发性免疫缺陷病的根治手段。但是由于缺少人类白细胞抗原(HLA)相合供体，以及移植后可能发生移植物抗宿主病(GVHD)，使该方法始终难以在临床推广、应用。近年来，基因编辑和干细胞生物学技术发展迅速，利用患者自体造血干/祖细胞(HS/PC)进行基因治疗的方法日渐兴起，成为遗传性血液系统疾病基因治疗领域的的研究热点。一方面，基因治疗从根源上避免了免疫排斥的难题；另一方面，成簇规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)-CRISPR相关蛋白(Cas)9系统的发现，使靶向基因治疗更具有可行性。CRISPR-Cas9系统能够对靶向基因进行定点剪切，达到修饰基因组DNA的目的。因此，笔者主要就基因编辑技术、遗传性血液系统疾病基因治疗的临床研究进展，以及基因治疗面临的挑战和发展方向进行阐述。
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大多数遗传性血液系统疾病，如原发性免疫缺陷、血红蛋白病、储存和代谢障碍、先天性红细胞减少症和干细胞缺陷等，均可以采取异基因造血干细胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT)进行治疗[1]。但是缺少人类白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)相合供体是allo-HSCT面临的较大阻碍，移植后发生移植物抗宿主病(graft versus host disease，GVHD)是导致患者预后不良的主要原因。基因治疗利用患者自体造血干/祖细胞(hematopoietic stem/progenitor cell，HS/PC)进行基因编辑，能够有效避免免疫排斥反应，并且由于自体HS/PC缺乏免疫原性，可以降低移植前的预处理强度。1990年，美国国立卫生研究院(National Institutes of Health，NIH)的Anderson团队通过逆转录病毒载体将腺苷酸脱氨酶(adenosine deaminase，ADA)基因转导入2例ADA缺陷的重症联合免疫缺陷(ADA deficient severe combined immunodeficiency disease，ADA-SCID)患儿的T细胞，接受治疗后患儿ADA水平有所提升，T细胞数量恢复正常，细胞和体液免疫反应也恢复正常[2]。这是历史上首例基因治疗的临床试验，其研究成果也成为基因治疗历史上重要的里程碑。此后，大部分相关研究开始利用病毒载体将遗传物质转导入靶细胞，然而这种方式可能会产生插入突变，并且校正效率较低。近年来，治疗性基因编辑逐渐成为基因治疗研究的热点，其在传统基因治疗的基础上提高了靶向特异性，对遗传性疾病，尤其是单基因遗传病的治疗具有重要的意义。其中，成簇规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences，CRISPR)-CRISPR相关蛋白(CRISPR-associated protein，Cas)9系统因其高效、多位点编辑能力和易于传递的特点，受到越来越多的关注。笔者拟就基因编辑技术、遗传性血液系统疾病基因治疗的临床研究进展及挑战进行阐述如下，旨在探讨相关研究成果对于基因治疗临床转化的参考价值，同时为基因治疗的优化提供新的方向。
CRISPR-Cas9系统最早来源于细菌和古细菌中进化的适应性免疫系统，以防御入侵的质粒和病毒。2013年，多个研究团队先后发表了CRISPR-Cas9系统在哺乳动物基因编辑中的应用[3]。与其他基因编辑技术相比，CRISPR-Cas9系统具有容易设计、特异性高、基因编辑效率高，以及原材料的可扩展性等优势，有望成为基因编辑临床治疗的优先选择[4]。
目前，CRISPR-Cas9系统在治疗β-血红蛋白病方面已经取得了一定研究进展。Wu等[5]采用Cas9-单导向RNA(single guide RNA，sgRNA)RNP在CD34＋ HS/PC中靶向B细胞淋巴瘤/白血病(B-cell lymphoma/leukemia，BCL)11A的＋58红系增强子，利用非同源末端修复降低了BCL11A的表达水平，并诱导HS/PC产生胎儿γ-珠蛋白。已经有研究者开展了利用CRISPR-Cas9系统治疗β-地中海贫血和镰状细胞病(sickle cell disease，SCD)的临床试验(NCT03655678、NCT03735287)，目前正在招募受试者。
此外，治疗获得性免疫缺陷综合征(acquired immune deficiency syndrome，AIDS)的2个治疗靶点C-C趋化因子受体(C-C chemokine receptor，CCR)5和C-X-C趋化因子受体(C-X-C chemokine receptor，CXCR)4也是研究者一直以来关注的焦点。近期，Xu等[6]在关于CRISPR-Cas9系统编辑HS/PC治疗AIDS合并急性淋巴细胞白血病患者的研究中，将1例急性淋巴细胞白血病患者的HS/PC进行CRISPR-Cas9系统编辑去除CCR5后，回输至该患者体内，实现了基因编辑治疗后HS/PC的长期植入，患者病情达完全缓解(complete remission，CR)，并且没有发生与基因编辑相关的不良事件。但是目前CRISPR-Cas9系统编辑去除CCR5的靶向效率较低，不足以治愈人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)-1感染者，还需要进一步提高基因编辑效率，改进基因治疗方案。
CRISPR-Cas9系统的唯一序列限制来自于紧邻目标位点3′端的原间隔相邻基序(protospacer-adjacent motif，PAM)。基因编辑技术中，通常使用来自化脓性链球菌的Cas9结合和切割DNA时，需要5′-NGG-3′PAM序列参与。目前，研究者通过化脓性链球菌以外物种衍生的Cas9同源物，或者采取基因工程技术获得的Cas9变异体，尝试靶向不同的PAM位点。2018年，Nishimasu等[7]报道了1种可以识别NG PAM序列的化脓性链球菌Cas9(Streptococcus pyogenes Cas9 enzyme，SpCas9)变异体；同年，文献报道了另一种PAM SpCas9变异体(XCas9)，其均可以识别包括NG、GAA和GAT在内的广泛的PAM序列[8]。
CRISPR-Cas9系统最主要的缺点是脱靶效应(off-target effect，OTE)。有研究者通过突变Cas9蛋白中的特定氨基酸，建立高保真的CRISPR-Cas9系统，可提高基因编辑特异性，减少OTE[9,10,11,12]。然而，Vakulskas等[13]发现，在RNP的介导下，eSpCas9和SpCas9-HF1的特异性虽然升高，但是靶向效率降低。研究者筛选出具有RNP活性的R691A(HiFi Cas9)变异体，发现与野生型Cas9相比，其在CD34＋ HS/PC中保持高度的活性和特异性，并且以高水平表达纠正了引起镰状细胞贫血症(sickle cell disease，SCD)患者的β珠蛋白基因Glu6Val突变，同时将OTE减少至野生型Cas9的1/20。
除了HS/PC，人多能干细胞(human pluripotent stem cell，hPSC)也是基因治疗中使用的重要细胞来源。有研究者发现，CRISPR-Cas9系统诱导的双链断裂引发了p53依赖的毒性反应，对携带野生型p53基因的hPSC进行精准基因编辑的靶向效率严重下降，限制了CRISPR-Cas9系统在hPSC中的应用[14]。此外，有研究结果表明，人体内存在对于CRISPR-Cas9系统的适应性免疫[15]。目前尚不清楚人体免疫系统是否会对转导的细胞产生破坏，但如果CRISPR-Cas9系统应用于临床，则需要考虑到这一因素。CRISPR-Cas9系统为基因工程领域提供了一种全新、简便可行且更加高效的选择，同时也产生了许多尚待解决的科学问题，未来走向临床转化还需要进行更深入的研究。
造血干细胞(hematopoietic stem cell，HSC)具有良好的自我更新和分化为各类血细胞的潜力，因此针对遗传性血液系统疾病的基因治疗中，HSC是其理想靶点。遗传性血液系统疾病，如地中海贫血、范科尼贫血等根治手段为HSC移植(HSC transplantation，HSCT)，其成功取决于能否找到HLA高度相合的供者，而实际上大多数患者缺乏匹配供者[16]。在这种情况下，基因治疗消除了对HSC供者的要求，是新的治疗选择。近年来，世界各地陆续开展了有关遗传性血液系统疾病基因治疗的临床试验，并取得了初步的研究成果。笔者主要介绍β-血红蛋白病，Wiskott-Aldrich综合征(Wiskott-Aldrich syndrome，WAS)，范可尼贫血(Fanconi anemia，FA)及黏多糖累积病(mucopolysaccharidoses，MPS)基因治疗的临床研究进展。
β-血红蛋白病，包括β-地中海贫血和镰状细胞病，是最常见的单基因遗传疾病之一。这2种疾病都是由于HBB基因点突变引起。最初的临床试验大多是采用直接纠正HBB基因点突变的方式。在2项Ⅰ/Ⅱ期临床研究(HGB-204、HGB-205)中，研究者采用编码成年人血红蛋白HbAT87Q的LentiGlobinBB305载体对22例输血依赖性地中海贫血(transfusion-dependent thalassemia，TDT)患者进行体内转导[17]。基因治疗后几乎所有非β0/β0基因型的患者都不再依赖输血，在9例β0/β0基因型或存在IVS1-1102拷贝突变的患者中，3例患者不再依赖输血，其他6例患者输血需求减少。随后另一项Ⅰ/Ⅱ期临床试验中，研究者采用自失活慢病毒载体(self-inactivating lentiviral vector，SINLV)转导的HSC对9例TDT患者进行骨内注射，其中包含有β0基因型或者伴严重β＋基因突变的3例成年患者和6例患儿，治疗后成年患者输血需求减少，4例可评估疗效的患儿中，3例在基因治疗后不再依赖输血[18]。上述临床研究结果证实，β-血红蛋白病患者接受基因治疗的有效性，但是对于部分患者，特别是伴严重贫血的患者，尽管成功地进行了基因治疗，输血需求依然存在，治疗后仍然未达到最佳的血红蛋白水平。
WAS是编码WAS蛋白的基因突变导致的X连锁原发性免疫缺陷。HSCT是WAS的首选治疗方法，但由于其应用上的固有缺陷，基因治疗逐渐被应用于治疗该病。Ferrua等[19]利用WAS基因内源启动子调控的SINLV治疗8例重症WAS患儿，在治疗12个月后，患儿WAS蛋白呈阳性的淋巴细胞和血小板比例均较治疗前明显增加，严重感染事件减少。7例随访超过1年的患儿不再依赖免疫球蛋白治疗，并且对疫苗的抗原特异性反应呈阳性。
除WAS患儿外，成年患者也有可能从基因治疗方案中获益。Morris等[20]报道了1例脾切除术后的WAS重症患者，其年龄为30岁，患者接受慢病毒载体(lentiviral vector，LV)介导的自体基因治疗后，不再依赖免疫抑制和免疫球蛋白支持治疗。该研究首次证明了使用LV介导的自体基因治疗对于患有严重慢性并发症的WAS成年患者是一种可行的策略。WAS基因治疗仍然存在一定限制，患者接受基因治疗后，其血小板计数和WAS蛋白呈阳性血小板比例较治疗前有所上升，但是大部分患者的血小板计数并未完全恢复至正常参考值范围。血小板计数的恢复可能与接受转导细胞的剂量有关。根据目前相关研究经验，LV介导的HS/PC基因治疗方案可使WAS成年患者显著获益，可以考虑作为治疗WAS的选择之一，然而该基因治疗方案能否成功治愈WAS患者，需要更长的观察期[21]。
FA是一种罕见的遗传性血液系统疾病，与DNA链间铰链修复缺陷而引起的染色体不稳定有关。FA患者以先天畸形，骨髓衰竭(bone marrow failure，BMF)和易患癌症为主要临床表现[22]。欧洲血液和骨髓移植组织(European Group for Blood and Marrow Transplantation)统计分析1972-2009年795例接受HSCT的FA患者的数据发现，接受HSCT后FA患者的长期生存仍然在很大程度上受到与死亡直接相关的继发性恶性肿瘤(其中89%为实体瘤)的影响。慢性GVHD(chronic GVHD，cGVHD)是继发性恶性肿瘤的危险因素之一[23]。自体HS/PC基因治疗不需要异体供体，因此没有GVHD发生风险。2019年，Río等[24]报道了4例FA患儿接受LV介导的基因治疗后的随访数据，基因治疗后HSC在FA A型患儿体内表现出植入和增殖优势，并且没有表现出遗传学相关的异常。这说明基因治疗为FA患者提供了一种低毒性的治疗选择。
FA患者的HSC对培养条件高度敏感，并且随着年龄的增长，FA患者HSC数量减少，很难分离足够数量的细胞。因此，未来的最佳选择是通过直接向患者体内注射基因治疗载体靶向作用于HSC。在血液中的传播可能会使基因治疗载体稀释导致转导效率降低，或者转导非靶细胞而产生不良反应。因此，体内转导必须针对靶细胞，以便在提高转导效率的同时避免载体扩散，针对BMF和FA的HSC靶向基因治疗将逐步成为未来该领域的研究热点[25]。
MPS是一组由于溶酶体酶缺陷导致未降解的糖胺聚糖在体内多个组织和器官堆积的溶酶体累积病。尽管酶替代治疗和HSCT在延缓MPS疾病进展方面具有一定优势，但是酶替代治疗具有一定的局限性：①需要每周注射；②药物在外周血中半衰期短，治疗费用高；③对骨骼和中枢神经系统病变的作用有限[26]。溶酶体酶具有顺行和逆行轴突运输、跨突触转移，以及从注射部位扩散的能力，少量转导细胞可以将溶酶体酶分布到中枢神经系统的广泛区域，基因治疗有可能在1次干预后使溶酶体酶持续表达数年[27]。基于这些特点，基因治疗是MPS理想的治疗方案。
2017年，Tardieu等[28]利用编码人α-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(α-N-acetylglucosaminidase，NAGLU)的AAV2/5完成了MPS ⅢB的Ⅰ/Ⅱ期临床试验，评估了MPS患儿接受基因治疗后30个月的各项神经系统相关指标。该研究结果表明，患儿腰部脑脊液中NAGLU活性是健康儿童的15%～20%。所有患儿的神经认知进展都有所改善，年龄最小的患儿神经系统功能接近健康儿童。基因治疗在改善MPS患儿的神经认知及行为方面体现了独特的优势，未来将有可能成为MPS重要的治疗手段之一。
部分LV在整合到癌症相关基因后可能导致宿主细胞显著的克隆性增殖。在β-地中海贫血的LG001临床试验中，整合的载体导致有核红细胞中HMGA2的转录激活，HMGA2 mRNA表达水平显著增加。与输注前相比，输注体外进行基因转导的有核红细胞后16个月，有核红细胞中HMGA2的表达水平增加约10 000倍[29]。随后，有文献报道，患者HMGA2位点的相对克隆优势已经自发消退，修饰后的血红蛋白维持在稳定的水平[16]。其他LV转导基因治疗试验已经报道了在癌症相关基因内或附近有整合位点的克隆瞬时出现，但是没有相关临床不良反应发生。虽然新一代LV和非整合型载体的安全性已经有了较大的提升，但是临床上仍然需要对接受基因治疗的各类遗传性血液系统疾病患者进行持续随访，以了解这些载体的长期安全性和有效性。
体外基因治疗主要是利用患者自体HS/PC，在体外进行基因修饰后重新植入患者体内，因此HS/PC的转导效率及其体内植入率对基因治疗疗效至关重要。2017年，Piras等[30]发现，LV转导HS/PC激活了p53信号通路，从而增加了细胞凋亡，延迟了HS/PC增殖并降低其植入能力，这些影响在HS/PC的短期增殖中更为明显。为了增加载体转导效率和优化基因修饰HS/PC产品的产量，许多研究团队研究发现，通过添加小分子和细胞因子或者作用机制不同的分子组合，可以提高载体的转导效率，增加转导后HS/PC的植入。Heffner等[31]对生物活性小分子进行筛选后发现，前列腺素E2能使LV转导CD34＋细胞的效率增加约2倍。Lewis等[32]研究发现，丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂星形孢子素能够促进HS/PC的LV转导，星形孢子素和前列腺素E2通过不同的机制发挥作用，二者联合应用可进一步提高LV转导效率。2018年，Petrillo等[33]报道，环孢菌素H可以解除LV转导HS/PC的早期阻滞，并且能够通过抑制干扰素诱导的跨膜蛋白3，提高HS/PC的基因转导效率。随后，该研究者比较了基于环孢菌素H的1次转导方案与标准的2次转导方案的效果，前者的HS/PC植入水平更高，并且体现了较高的安全性[34]。同时，环孢菌素H显著降低了HS/PC的增殖，使HS/PC保持静止状态，从而在体内获得更高的植入率。近年来，许多有关提高HS/PC的转导效率和体内植入率的研究有助于开发更加高效和安全的基因治疗方案，对于未来应用于遗传性血液系统疾病的临床治疗具有一定的借鉴意义。
尽管近年来利用腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)载体进行基因转导取得了巨大的研究进展，但是人体内存在的AAV中和抗体可降低AAV的转导效率，而识别AAV衣壳抗原的CD8＋ T细胞可导致对AAV转导细胞的免疫排斥[35]。虽然后者可以通过短暂的免疫抑制缓解，但是目前还没有针对AAV中和抗体的有效解决手段。Ojala等[36]构建了6个亲本血清型(AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV8和AAV9)和7个交叉位置组成的SCHMA AAV衣壳文库，用严格的体内依赖Cre的选择策略筛选在脑室下区转导成年人神经干细胞(neural stem cell，NSC)的SCH变异体。SCH9变异体感染了60%的NSC，在小鼠脑中的载体荧光标记表达水平是AAV9的24倍，转导效率是AAV9的12倍。而且，由于其嵌合性质，中和SCH9所需的抗体效价比其亲本血清型高2～10倍。上述研究结果证实，通过创建AAV变异体衣壳文库，产生可以逃避免疫系统病毒变异体的可行性。
也有相关研究者通过对AAV的表面引入化学络合和修饰，以降低机体对AAV转导细胞的免疫反应。Katrekar等[37]利用非天然氨基酸(unnatural amino acids，UAA)将寡核苷酸偶联到AVV衣壳上，进一步设计出基于脂质的隐蔽式AAV，隐蔽式AAV对中和抗体表现出强大的屏蔽作用，并且在包装SpCas9系统后显示了比UAA-AAV高出近4倍的编辑效率。2019年，Moreno等[38]研究结果证实，连续使用Cas9和AAV的免疫正交直向同源物可以逃避适应性免疫反应，从而克服免疫识别对基因编辑的抑制。虽然研究结果为避免针对AAV的免疫反应提供了一种潜在解决方案，但是在实际应用上仍然存在限制。例如，实验中使用的小鼠主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)多样性有限，并不能完全模拟人体内的免疫学特征。
许多遗传性血液系统疾病的临床症状严重，治疗费用高、周期长，给患者家庭带来了沉重的负担。虽然HSCT是根治此类疾病的有效手段，但对于大部分患者而言并不适用，其移植后可能发生的不良反应也严重影响患者预后，基因治疗的发展给遗传性血液系统疾病患者带来了新的希望。在中国，1991年已经开始进行了世界上首例血友病B的基因治疗临床试验，并达到有效的治疗效果，到目前为止已有至少6种基因治疗方案进入或者即将进入临床试验。但中国的基因治疗产业与美国相比较为落后，正处于成长阶段，绝大部分基因治疗方案还处于实验室研究阶段。此外，HS/PC的来源有限，缺乏有效的扩增和植入手段，基因编辑引起的细胞毒性、OTE等一系列问题都限制了基因治疗的临床应用，并且亟待解决。基因治疗涵盖的研究范围十分广泛，无论采用何种方式，如何提高基因治疗的转导效率和安全性都将是未来进行相关研究的重点。
所有作者均声明不存在利益冲突
