探究SQSTM1在甲状腺乳头状癌中的表达及其对甲状腺乳头状癌细胞TPC-1侵袭和迁移能力的影响。
采集2019年4至6月郑州大学第一附属医院收治的21例甲状腺乳头状癌患者切除手术的癌组织和癌旁组织，通过逆转录-聚合酶链反应（RT-qPCR）方法检测组织中SQSTM1的表达情况；通过慢病毒转染在TPC-1细胞中构建SQSTM1缺失细胞系SQSTM1-KD-TPC-1， RT-qPCR从基因水平检测SQSTM1在TPC-1 和SQSTM1-KD-TPC-1细胞中的表达；transwell法检测SQSTM1敲低前后TPC-1侵袭和迁移的变化情况；MTT和平板克隆形成实验检测SQSTM1敲低后TPC-1细胞增殖能力的变化；通过RT-qPCR检测增殖相关蛋白的表达情况，从基因水平进一步验证肿瘤细胞对增殖能力的影响。
甲状腺乳头状癌组织中SQSTM1的表达明显高于正常癌旁组织，有76.2%（16/21）的患者mRNA呈现高表达；敲低SQSTM1明显抑制肿瘤增殖、侵袭和迁移的能力，且增殖相关蛋白表达明显减小（P均<0.01），表明SQSTM1参与增殖相关通路机制的调控。
SQSTM1在甲状腺乳头状癌细胞株TPC-1中明显促进细胞侵袭、迁移和增殖，可能是潜在的基因治疗靶点。
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甲状腺乳头状癌是最高发的头颈部肿瘤之一，是甲状腺肿瘤最常见的病理类型，占其80%~90%［1, 2, 3］。近年来有研究表明，甲状腺癌的发病年龄呈现年轻化趋势，且多为甲状腺乳头状癌［4］。甲状腺肿瘤具有发病率高、易转移、易复发的特点，如何控制患者的复发转移是临床工作中的一项重要内容［5］。其中自噬和泛素化在肿瘤细胞中扮演了重要角色［6］。本研究检测了SQSTM1在甲状腺乳头状癌组织和癌旁组织中的表达情况， 利用慢病毒转染在甲状腺乳头状癌细胞（TPC-1）中构建SQSTM1敲低细胞系SQSTMI-KD-TPC-1，研究SQSTM1对肿瘤细胞侵袭、迁移、增殖能力的影响，并通过逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）从mRNA层面进一步验证侵袭迁移相关蛋白的表达情况，从多个层面探讨SQSTM1对甲状腺乳头状癌的调控机制，为探究甲状腺乳头状癌新的治疗靶点提供研究基础。
1.临床资料：收集郑州大学第一附属医院2019年4至10月首次行甲状腺乳头状癌切除术的组织标本21例，经病理医师诊断后放入液氮保存。本研究得到患者的知情同意。
2.细胞培养：人甲状腺乳头状癌肿瘤细胞株TPC-1来自上海瑞金医院赠送，RPMI-1640培养基购自北京索莱宝科技有限公司；SQSTM1慢病毒购自上海吉凯基因化学技术有限公司；胰蛋白酶购自北京雷根生物技术有限公司；胎牛血清购自美国Gemini公司。细胞在RPMI-1640培养液和10%胎牛血清配成的完全培养基中培养，培养条件为37 ℃、5%CO2恒温培养箱，1.25 g/L胰蛋白酶消化传代，放入液氮罐长期保存。
3.慢病毒转染：取对数生长期细胞TPC-1接种于24孔板中，根据感染复数（MOI）=20及病毒滴度，加入相应病毒，37 ℃培养8~12 h，更换为完全培养基继续培养，约72 h后观察荧光转染效率，细胞形态发生明显变化，选择合适时间进行后续实验。
4. transwell侵袭迁移实验：侵袭实验：取对数生长期的细胞用无血清培养液制成密度为2×105个/ml的单细胞悬液，将transwell小室置于24孔板中。取Matrigel胶与无血清RPMI-1640培养基以1∶8比例稀释，包被于transwell小室底部膜的上室面，置于37 ℃培养箱30 min使其凝固，水化后加入制备好的无血清细胞悬液200 μl，下室加入10%胎牛血清培养基600 μl，置入37 ℃、5%CO2培养箱中孵育，0、12、 24、 36、48 h取出固定染色，倒置显微镜观察穿过transwell小室底部膜的下室面细胞，随机选取5个低倍视野并计数。迁移实验：取对数生长期的细胞用无血清培养液制成密度为2×105个/ml的单细胞悬液，将transwell小室置于24孔板中。于transwell小室上室加入制备好的细胞悬液200 μl，下室加入带血清培养基600 μl，置入37 ℃、5%CO2培养箱中孵育，0、12、 24、 36、48 h取出固定染色，倒置显微镜观察穿过transwell小室底部膜的下室面细胞，随机选取5个低倍视野并计数。
5.MTT细胞增殖实验：取对数生长期的细胞制成单细胞悬液，调整浓度为5×104个/ml，96孔板每孔加入100 μl，设4个复孔，5%CO2、37 ℃孵育，以12、24、36、48 h时间点分别加入0.5% MTT 20 μl，继续培养4 h后，加入二甲基亚砜150 μl，摇床上低速震荡10 min后，在酶联免疫检测仪OD490 nm处测各孔的吸光度（A）值，绘制细胞增殖曲线。
6.平板集落形成实验：取对数生长期细胞于6 cm培养皿（200个/皿）中培养2周，每组重复3次。37 ℃、5%CO2培养箱中孵育，根据细胞生长情况更换新鲜培养基。4%多聚甲醛固定30 min，结晶紫染色30 min，小心冲洗晾干后计数统计。
7.RT-qPCR：取对数生长期的细胞，TRIzol法提取总RNA，检测RNA浓度、纯度和完整性合格后，使用购自日本TaKaRa公司的Prime Script RT reagent Kit和荧光定量试剂盒按说明书操作，去除基因组gDNA，反转录成cDNA，通过聚合酶链式反应扩增特定DNA片段，测得CT值，计算2-ΔΔCT并绘制柱状图。使用的引物序列如表1。
目的基因及引物序列
目的基因及引物序列
| 目的 基因 | 引物序列 |
|---|---|
| CCND | 上游: 5′--3′ TTCCTGTCCTACTACCGCCTCA |
| 下游: 5′--3′ TCCACCTCCTCCTCCTCCTCTT | |
| Ki67 | 上游: 5′--3′ AAGGACTGGAAATAGCAGAGG |
| 下游: 5′--3′ GGATGTGATGGCTGATGAA | |
| PCNA | 上游: 5′--3′ CTTCCCGCCGTCCTGTAGC |
| 下游: 5′--3′ GCCGGCGCATTTTAGTATTTTG | |
| CHERK1 | 上游: 5′--3′ TCCCCCGGGACCGGGCTGAAGTAAAGCAT |
| 下游: 5′--3′ CCCAAGCTTCTCCCAAGCACACCGAAGGT | |
| CHERK2 | 上游: 5′--3′ CCAGCACGATGCCAAACTCCA |
| 下游: 5′--3′ CGTGATACTATACAACAAAGGGTC |
8.统计学处理：应用SPSS 22.0 统计分析软件对数据进行统计学处理，每组实验重复3次，服从正态分布的计量资料以表示，组间比较采用独立样本t检验，双侧检验，检验水准α=0.05。
1. SQSTM1在甲状腺乳头状癌中的表达：结果显示SQSTM1 mRNA在甲状腺乳头状癌组织中的表达明显高于癌旁组织，有76.2%（16/21）的患者mRNA呈现高表达，差异有统计学意义（P<0.01，图1），提示SQSTM1的异常上调可能在甲状腺乳头状癌的发生发展过程中发挥重要作用。
2. SQSTM1慢病毒转染：细胞荧光及RT-qPCR检测SQSTM1的mRNA表达水平检测转染效果，结果显示在MOI值20的情况下，慢病毒敲低SQSTM1的效果最显著（图2），表明SQSTM1-KO-TPC-1细胞系构建成功。
注：1为甲状腺乳头状癌细胞TPC‑1；2为SQSTM1慢病毒
3. SQSTM1抑制甲状腺乳头状癌细胞TPC-1的侵袭和迁移能力：通过transwell侵袭迁移实验可见，敲低SQSTM1后，穿过transwell小室下层膜的细胞数明显减少，细胞侵袭和迁移能力明显降低，说明SQSTM1能促进甲状腺乳头状癌细胞的侵袭和迁移（图3）。
4.SQSTM1抑制甲状腺乳头状癌TPC-1的增殖能力：通过MTT法和集落形成实验检测细胞生长情况，可见SQSTM1敲低后，集落形成的能力减弱，细胞生长速度明显变缓（图4，P<0.05）。
5. SQSTM1影响侵袭迁移相关分子的表达：为探究SQSTM1 影响甲状腺乳头状癌TPC-1细胞增殖的可能机制，检测SQSTM1基因沉默前后，TPC-1细胞中增殖相关分子CCND、Ki67、PCNA、CHEK1和CHEK2的表达。结果显示，与对照组相比，转染SQSTM1 shRNA 后，p62-KO-TPC-1中CCND、Ki67、PCNA、CHEK1和CHEK2的mRNA表达水平均下降（P<0.05），尤以Ki67、CHEK1最为明显（P<0.01，图5）。
SQSTM1是自噬-泛素蛋白酶体降解途径的重要调控分子，通过与小泛素分子结合，将底物蛋白运送至自噬溶酶体完成底物蛋白降解，可以调控多种细胞生命活动相关的分子通路。细胞的蛋白降解系统有助于大分子蛋白在胞内消化再分布，维持代谢平衡，对细胞调节自身能量状态以适应外界环境，维持细胞生存发挥重要作用。在本研究中，通过临床检验、体外实验和相关分子机制的探索，探讨SQSTM1沉默后对TPC-1生物学行为的影响。
有研究发现，在食管癌中SQSTM1高表达影响着肿瘤的发生发展过程，在乳腺癌中SQSTM1的高表达促进乳腺癌细胞的侵袭和迁移能力［7, 8］。本研究也有类似结果。
SQSTM1是泛素和自噬相关的货车蛋白，在调节细胞内蛋白降解中发挥重要作用［9］。有报道指出，SQSTM1参与细胞周期、细胞代谢、硒对过氧自由基的清除作用等多种细胞生物学活动［10］。SQSTM1基因突变与骨Paget病、髓系白血病、神经退行性疾病、肥胖、血管衰老、衰老病理和癌症密切相关［11, 12, 13, 14, 15］。
本研究表明，SQSTM1在甲状腺乳头状癌组织中的表达高于癌旁组织，在甲状腺乳头状癌细胞TPC-1中敲低SQSTM1后细胞增殖能力减弱，侵袭迁移能力受到抑制，增殖相关分子出现差异表达，差异具有统计学意义（P<0.05），提示SQSTM1高表达可促进甲状腺乳头状癌的生长和转移。但影响肿瘤细胞生物学行为的因素有很多，SQSTM1发挥功能所涉及的具体信号通路有待进一步研究探讨。
总之，本研究发现甲状腺乳头状癌中存在SQSTM1 的异常高表达，影响甲状腺乳头状癌细胞的增殖、侵袭和迁移，发挥促肿瘤作用。
所有作者均声明不存在利益冲突
