Treg是一群高度异质性的T细胞亚群。Miyara等^[8]根据CD45RA和叉头框蛋白(folkhead box protein，Foxp)3表达水平，将Treg分为3种主要亚群：①稳定表达CD45RA⁺ Foxp3^low静息Treg，②CD45RA^— Foxp3^high效应Treg, ③CD45RA^—Foxp3^low Treg。Foxp3特异性表达于成熟Treg，Foxp3基因缺失可造成Treg免疫抑制功能丧失，进而发生系统性自身免疫疾病^[9,10]，可将Foxp3的表达作为区分Treg与其他T细胞的特异性标志物。但有研究发现，在人活化效应T细胞中也可以短暂表达Foxp3，因此Foxp3并非Treg的特异性标志物。Treg低表达IL-7受体α链(CD127)，CD127联合CD4、CD25可作为进一步区分和分离纯化Treg的标志物^[11]。根据来源不同，可将Treg分为胸腺来源Treg(thymic Treg，tTreg)，又称为天然型Treg(natural Treg，nTreg)，以及外周来源Treg(peripheric Treg，pTreg)或者诱导型Treg(induced Treg，iTreg)。tTreg与iTreg在表观遗传学上存在较大差异，主要表现在Treg特异性去甲基化区域(Treg-specific demethylated region，TSDR)甲基化状态不同。TSDR是Foxp3基因位点中进化保守的非编码调控元件之一，TSDR去甲基化可使Foxp3稳定表达。在tTreg中TSDR完全去甲基化，而在iTreg中TSDR去甲基化状态不稳定，这也使过继性输注iTreg易丢失Foxp3表达，影响临床应用效果^[12]。由于TSDR去甲基化程度在2类Treg中存在差异，分析TSDR去甲基化程度可能是区分2类Treg的可靠方法。但是基于TSDR去甲基化程度的评估方法，需要对Treg进行固定和渗透，这一过程可造成细胞损伤，因此该方法多用于实验室中Treg亚群的鉴别，而临床很少应用。因此，目前尚无有效区分tTreg与iTreg的标志物。Treg是调节免疫反应的一类重要细胞，由于其高度异质性，对Treg亚群的分类目前仍存在争议。

Treg可以通过接触或者非接触依赖的方式抑制CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞、自然杀伤(natural killer，NK)细胞和树突状细胞(dendritic cell，DC)等的功能，进而诱导机体免疫耐受。Treg除通过分泌免疫抑制因子，如IL-10，TGF-β等，抑制T细胞功能，以及分泌穿孔素、颗粒酶直接引起效应T细胞凋亡外，亦可干扰细胞代谢，如Treg表达细胞外酶CD39和CD73，在CD39和CD73的联合作用下，可将促炎介质ATP转化为腺苷，腺苷与A2A受体(A2A receptor，A2AR)结合，可负向调节效应T细胞功能^[13]。近期研究发现，在GVHD小鼠模型中，阻断CD39/73-腺苷途径，而不阻断腺苷受体(adenosine receptor，AR)途径，亦可增加组织中T细胞浸润和血清细胞因子，如IL-2、TNF-α等的水平，使其GVHD相关症状加重^[14]。吲哚胺2, 3-双加氧酶(indoleamine 2, 3-dioxygenase，IDO)是色氨酸分解代谢的关键酶，具有免疫抑制作用。IDO发挥免疫抑制的可能机制是通过酶促反应耗竭局部外周组织中T细胞赖以生存的色氨酸或者促进色氨酸代谢产物犬尿氨酸在局部积聚，从而促进T细胞凋亡。Jasperson等^[15]在GVHD小鼠模型中发现，上调结肠中IDO水平，可局部降低T细胞增殖与生存，减轻GVHD组织损伤，并且IDO主要由APC，特别是DC产生。研究发现，Treg可通过细胞表面的细胞毒T淋巴细胞抗原(cytotoxic T lymphocyte antigen，CTLA)-4促进γ干扰素分泌，进而增加DC中IDO的活性，导致色氨酸分解代谢产物增加^[16]。T细胞的充分活化需要T细胞表面CD28与APC表面CD80/86结合产生共刺激信号，由于Treg组成性高表达CTLA-4，而CTLA-4与CD80/86结合的亲和力高于CD28^[17]，因此阻断T细胞活化的第二信号，引起T细胞免疫功能下降。亦有研究发现，CTLA-4可通过反式内吞作用捕获APC上的CD80/86至CTLA-4⁺细胞内进行降解^[18]，减低CD28对效应T细胞的共刺激作用。Treg在GVHD中的发挥免疫调节作用的具体机制尚未阐明，其潜在机制可能为通过多种途径影响效应T细胞的功能，从而调节机体免疫反应。

外周血中CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺Treg仅占CD4⁺T细胞的5%～10%。如何获得临床所需足够数量的Treg，并且保证Treg高纯度，免疫表型稳定及迁移特性等仍然是亟待解决的重要问题。体外诱导与扩增获得的iTreg，经输注后容易丢失Foxp3表达，甚至获得效应T细胞表型，从而限制了其临床应用。研究结果显示，CD4⁺初始T细胞与异基因DC在添加维生素C(100 μg/mL)iTreg诱导条件下共培养6～7 d，与未添加维生素C对照组相比，添加维生素C组iTreg表面Foxp3表达水平增加(P<0.05)。进一步分析发现，维生素C可以促进iTreg表面Foxp3的TSDR去甲基化，并且TSDR去甲基化的程度与tTreg相当，这可提高iTreg表面Foxp3表达的稳定性^[23]。将iTreg输注至GVHD小鼠模型中发现，与未添加维生素C对照组相比，经维生素C处理的iTreg，能够减少小鼠小肠和结肠炎症细胞浸润和上皮细胞的破坏程度，改善GVHD的症状，并且明显提高小鼠OS率(P<0.01)^[23]。研究发现，供者来源Treg与第三方来源Treg有相似的抑制GVHD发生的作用，这在人类白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)不相合移植小鼠模型中得到验证。第三方来源Treg能够应用于allo-HSCT后GVHD的预防，虽然供者来源Treg抑制GVHD的效果最好，但是在缺乏HLA匹配供者的情况下，第三方来源Treg仍然是一种极具潜力的细胞治疗替代方案^[24]。有研究从心脏病患儿摘除的胸腺中分离和扩增大量Foxp3⁺ nTreg，nTreg能够稳定表达Foxp3，有效抑制同种异体T细胞反应，并且与从外周血来源CD25⁺ iTreg相比，nTreg在炎症条件下更能保持细胞表型与免疫抑制功能稳定。在GVHD小鼠模型中，与单纯输注外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)比较，输注胸腺来源Treg联合PBMC的小鼠中位OS期明显延长[(24.6±11.2)d比(8.7±1.4) d，P＝0.002]^[25]。McKenna等^[26]应用KT64/86 aAPC扩增脐血来源Treg，并且在扩增培养12 d后再次应用aAPC刺激Treg增殖。与CD3/28微珠扩增效果比较，aAPC初次刺激及再刺激所扩增的Treg数量分别增加8和20～30倍；体外扩增或者输注至患者体内经aAPC扩增的Treg均稳定表达Foxp3；与仅接受PBMC的GVHD模型小鼠相比，接受aAPC扩增Treg与PBMC比例为1∶1的小鼠OS率显著提高(P<0.016)。目前限制Treg用于临床的主要障碍为Treg数量缺乏。扩增第三方来源的Treg或者改进Treg扩增方案，有效刺激Treg增殖，产生足够数量的Treg，将可加快Treg应用于临床。

Gu等^[27]采用全反式维甲酸扩增来源于肝移植患者的iTreg，并将其输注至GVHD小鼠模型体内，发现输注患者iTreg与健康个体iTreg小鼠的OS率相比，差异无统计学意义(P>0.05)；与未输注iTreg的空白对照小鼠相比，输注患者iTreg小鼠的GVHD严重程度显著下降(P<0.01)，并且OS率增加(P<0.001)。Chopra等^[28]构建了小鼠TNF受体(TNF receptor，TNFR)2选择性激动剂STAR2，采用免疫荧光技术检测发现，与空白对照小鼠相比，在STAR2处理的小鼠次级淋巴器官和外周器官中，Treg数量明显增加；并且采用STAR2处理的allo-HSCT小鼠模型，其中位OS期从16 d延长至>40 d。该研究亦发现，与空白对照相比，人TNFR2特异性激动剂也可以在体外激活人Treg扩增。文献报道，在allo-HSCT前应用小鼠STAR2可在小鼠体内扩增Treg，降低GVHD严重程度，同时不影响allo-HSCT后GVL效应^[28]。上述研究结果证实，扩增受者体内的Treg具有改善GVHD的作用，但是其有效性及安全性需要更多的研究予以验证。

IL-2是Th1类细胞因子，活化的效应T细胞表面IL-2受体表达水平增加。IL-2作为调控T细胞活化、增殖的重要细胞因子，参与GVHD的发生、发展。Treg的存活及增殖也需要IL-2的介导。达利珠单抗(daclizumab)是一种人源化单克隆抗体，可以与CD25结合，从而阻断CD25与IL-2结合，通常作为aGVHD的二线治疗方案。然而，一项多中心、随机、双盲临床研究发现，无关供者allo-HSCT后接受达利珠单抗治疗的患者与接受安慰剂治疗者相比，cGVHD发生风险增加(HR＝1.49, 95%CI：1.0～2.3，P＝0.08)，复发风险降低(HR＝0.57，95%CI：0.3～1.0，P＝0.05)。接受安慰剂、达利珠单抗0.3、1.2 mg/kg患者aGVHD发生率分别为66%(43/65)、72%(50/69)及75%(57/75)，3者相比，差异无统计学意义(P＝0.43)^[29]。进一步分析发现，移植后早期，与接受安慰剂治疗的患者相比，接受达利珠单抗治疗者，T细胞中Treg比例下降(安慰剂组比达利珠单抗0.3 mg/kg组：28%比16%，P<0.000 1；安慰剂组比达利珠单抗1.2 mg/kg组：28%比18%，P<0.000 1)；但是移植1年后，与安慰剂组相比，达利珠单抗1.2 mg/kg治疗组CD4⁺记忆T细胞占CD4⁺T细胞比例增加(10%比21%，P＝0.02)。因此，在达利珠单抗治疗过程中，aGVHD发生率无明显改善，而这可能是达利珠单抗在降低效应T细胞反应活性的同时，延缓Treg重建，而促进免疫记忆所致^[29]。Hirakawa等^[30]研究发现，低浓度IL-2在体外可选择性诱导Helios⁺ CD4⁺ Treg中信号传导及转录激活蛋白(signal transducer and activator of transcription, STAT)5磷酸化，促进Treg的活化与增殖，而仅增加CD4⁺效应T细胞和CD8⁺ T细胞表面程序性细胞死亡因子(programmed-cell death, PD)-1表达水平，抑制效应T细胞活性。因此，该研究者认为，低浓度IL-2可改善GVHD的症状。Pérol等^[31]研究发现，给予供鼠IL-2处理可以增加移植物中Treg数量(P<0.001)，但是与移植物来源于PBS处理小鼠相比，接受经IL-2处理的小鼠移植物的受鼠GVHD发生率并未明显下降(P>0.05)；并且予受鼠不同浓度IL-2，均未发现IL-2能够减低GVHD发生风险，甚至高浓度IL-2可诱导GVHD发生。由此可见，IL-2可能对GVHD的发生发挥促进或者抑制的双重作用。Trotta等^[32]研发了一种人源化IL-2抗体，该抗体与IL-2结合可改变IL-2构象，使其优先促进Treg扩增，加快免疫重建。该人源化IL-2抗体已在GVHD小鼠模型中被证实是有效的，与单纯输注IL-2小鼠相比，输注IL-2-抗体复合物小鼠的OS率获得明显提高(P<0.05)。由于活化的效应T细胞和Treg均高表达CD25，明确不同IL-2剂量在免疫调节中发挥何种作用，如何正确利用IL-2以避免激活扩增的效应T细胞促进GVHD的发生仍有待解决。Hotta等^[33]研究发现，使用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)可以扩增CD4⁺ CD8^- DC，而CD4⁺ CD8^- DC倾向于优先促进Treg扩增。在cGVHD小鼠模型中应用GM-CSF可以减轻小鼠cGVHD症状；但是在应用GM-CSF与PBS对照处理的cGVHD小鼠模型中，Treg抑制Tcon的增殖能力相当。这可能是由于Treg/Tcon增加，而不是Treg抑制能力增强，因而改善了小鼠cGVHD症状。Treg和Tcon的生物学活性均同时受到IL-2的调节，合理应用IL-2，促进Treg对Tcon的免疫抑制作用，可能减低GVHD的发生风险。