探讨产前可疑Beckwith-Wiedemann综合征（Beckwith-Wiedemann syndrome, BWS）胎儿的遗传学检测，以提高该综合征的产前遗传学诊断率。
1例既往孕18周超声发现胎儿脐膨出、胎盘增厚引产孕妇，此次妊娠孕13周超声再次发现胎儿脐膨出、胎盘增厚。行绒毛活检取样术后，应用单核苷酸多态性微阵列（single nucleotide polymorphism array, SNP array）芯片对全基因组拷贝数变异分析，之后应用甲基化特异性多重连接探针扩增（methylation-specific multiplex ligation-dependent probe amplification, MS-MLPA）技术检测染色体11p15区域H19和KCNQ1基因的甲基化状态和拷贝数变化。同时采集胎儿父母外周血行染色体高分辨G显带核型分析和SNP array检测。
胎儿绒毛SNP array提示11p15.5区域有176 kb杂合缺失；MS-MLPA提示印记控制区域2甲基化缺失，KCNQ1（L02903）基因拷贝数减少50%。胎儿父母的SNP array检测和染色体G显带核型分析均未发现异常。诊断该例胎儿为BWS。
孕早期超声发现胎儿脐膨出、胎盘异常增厚等宫内异常表现时，应选择相应的遗传学检测，建议产前诊断选择MS-MLPA和SNP array，避免漏诊BWS。
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Beckwith-Wiedemann综合征(Beckwith-Wiedemannsyndrome,BWS,在线人类孟德尔遗传数据库编号130650)以巨舌、巨体、巨内脏、偏侧生长过快、腹壁缺陷、新生儿低血糖为特点,胎儿期最常见的表现为脐膨出,是最常见的生长过度综合征之一.据报道其发病率为1/10340,辅助生殖技术会导致胎儿BWS患病风险增加10倍[1,2].85%的BWS为散发,15%为家族遗传[3].该病致病机制多样化,需要应用多种遗传学检测方法.产前诊断常用的染色体核型分析和微阵列技术可能造成漏诊.国内已报道的基因诊断病例大多为新生儿期或儿童期诊断,产前诊断报道病例多为中、晚孕期通过影像学检查诊断[4,5].本研究报告的1例病例,为孕早期超声提示胎儿脐膨出,通过绒毛活检取样术联合应用单核苷酸多态性微阵列(singlenucleotidepolymorphismarray,SNParray)芯片、甲基化特异性多重连接依赖探针扩增(methylation-specificmultiplexligation-dependentprobeamplification,MS-MLPA)等遗传学检测方法产前诊断为BWS.根据此病例遗传学检测方法结合相关文献进行产前遗传学诊断探讨,旨在提高产前BWS的遗传学诊断率.
孕妇29岁，孕3产0，因"停经13周，外院超声发现胎儿脐膨出"于广东省妇幼保健院就诊，在本院复查超声示胎儿头臀长68 mm，颈项透明层厚度1.7 mm，脐膨出，胎盘增厚，内可见多个细小无回声区（图1）。夫妇双方既往体健，非近亲，否认家族遗传病史。孕妇初婚，此为第3次自然妊娠。2016年第1次妊娠，孕18周超声发现胎儿脐膨出、胎盘增厚、内见多个小无回声区（图2），诊断"不完全性葡萄胎"于孕20周引产，引产胎儿未行遗传学相关检查；个人原因人工流产1次，见家系图（图3）。为明确病因，拟对本例胎儿行遗传学检测。
注：BWS：Beckwith-Wiedemann综合征（Beckwith-Wiedemann syndrome）
注：BWS：Beckwith-Wiedemann综合征（Beckwith-Wiedemann syndrome）；箭头为先证者
夫妇双方知情同意后，孕13周在超声引导下经腹行绒毛活检取样术，采集绒毛置于有生理盐水的无菌试管中，进行SNP array检测。发现异常结果后再行MS-MLPA检测。采集胎儿父母外周血，分别用肝素和乙二胺四乙酸抗凝，进行外周血染色体高分辨G显带核型分析和SNP array检测。
采用美国Affymetrix公司CytoScanTM 750K芯片，按实验标准操作步骤对绒毛和血液样本进行DNA提取、杂交和全基因组扫描等操作并进行数据分析，查询在线人类孟德尔遗传数据库、UCSC基因组浏览器（UCSC Genome Browser）、细胞遗传学芯片标准化联盟（International Standards for Cytogenomic Arrays, ISCA）、基因组变异数据库（Database of Genomic Variants, DGV）、人类亚微观结构基因组变异和疾病表型数据库（Database of genomic variation and Phenotype in Humans using Ensembl Resource, DECIPHER）等数据库。
采用MS-MLPA方法检测胎儿染色体11p15区域H19和KCNQ1基因的甲基化状态和拷贝数变化，使用荷兰MRC-Holland公司生产的SALSA MLPA ME030-C1 BWS/RSS试剂盒。按照说明书，先用试剂盒提供的探针混合物对大约100 ng的基因组DNA进行变性和杂交过夜。然后将样本分成2部分，单独用连接酶处理，或用连接酶加HhaI酶处理。后用试剂盒中提供的试剂和引物进行聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）。PCR产物在毛细管电泳仪（3500型，美国应用生物系统公司）上分离检测。
将采集的胎儿父母外周血细胞接种在培养基中，在37 ℃培养箱培养72 h。终止培养前16 h，加入胸腺嘧啶核苷100 µl（终浓度为0.3 mg/ml）；终止培养前6 h，加入脱氧胞苷（终浓度为3 µg/ml）。培养72 h后，加入50 µl高浓度（100 mg/ml）秋水仙素（终浓度为2 µg/ml）作用12 min，经低渗、预固定、固定、制片、吉姆萨染色，全自动染色体扫描仪选取、拍摄核型，按照《人类细胞遗传学国际命名体制（ISCN）2016》分析和诊断染色体核型。
绒毛SNP array检测提示胎儿11p15.5区域有176 kb杂合缺失，结果为arr[hg19]11p15.5(2 344 807-2 520 511)×1（图4），该区域包括KCNQ1 5'端区域。应用MS-MLPA方法检测胎儿染色体11p15区域H19和KCNQ1基因的甲基化状态和拷贝数变化，结果提示印记控制区域（imprinting control region, ICR）2甲基化缺失，KCNQ1（L02903）探针显示基因拷贝数为1（图5）。胎儿父母的染色体G显带核型分析和SNP array检测均未发现异常。告知胎儿预后，胎儿父母慎重考虑后选择于孕27周终止妊娠，胎儿引产后行病理检查。病理结果提示引产胎儿为男性，脐带根部可见肠管膨出至脐带内，自旋3周；嘴微张，舌较大（图6）；双侧肢体生长对称，无明显偏侧生长过快；左肾大小4 cm×2 cm×1.5 cm，重量6 g；右肾大小3.5 cm×2 cm×1.5 cm，重量6.5 g，均较该孕周正常胎儿肾脏大；肝脏和脾脏未见明显增大。
注：SNP array：单核苷酸多态性微阵列（single nucleotide polymorphism array）
注：MS-MLPA：甲基化特异性多重连接依赖探针扩增（methylation-specific multiplex ligation-dependent probe amplification）；ICR：印记控制区域（imprinting control region）
BWS是最常见的先天性过度生长综合征之一，临床异质性较大，可根据临床表现诊断，其发病机制通常是由于染色体11p15.5区域的基因组印记异常导致[6]。BWS相关的2个印记区域分别为印记区域1和印记区域2。印记区域1位于近端粒端，包含印记基因H19和IGF2，由ICR1调控，ICR1通常只在父系等位基因甲基化；印记区域2位于近着丝粒端，包含印记基因CDKN1C、KCNQ1OT1和KCNQ1，由ICR2调控，ICR2通常只在母系等位基因甲基化，ICR2位于KCNQ1基因内含子10中（图7），ICR2的甲基化缺失是发生BWS最常见的原因（50%~60%），其他原因包括父源11p15单亲二体（20%~25%），ICR1过度甲基化（5%~10%）[7]，来自母体的CDKN1C基因致病变异（5%）[8]，11号染色体的倒位或易位等结构重排（<1%）[9]，11p15区域微缺失、微重复。以往研究发现导致BWS的不同分子机制伴随不同的临床表型，ICR2甲基化缺失和CDKN1C突变一般与脐膨出相关，父源性11p15单亲二体与偏侧肢体肥大相关，ICR1过度甲基化和父源性11p15单亲二体患者患Wilms瘤的风险显著高于其他，但并不存在绝对特异性，因此当产前发现BWS相关表现时，建议对多种机制进行排查[3]。所以针对BWS的产前遗传学检测应优先考虑MS-MLPA，同时进行ICR1和ICR2甲基化和拷贝数变化检测，如未发现异常可通过SNP array检测单亲二体、微缺失、微重复，或应用测序检测CDKN1C是否存在致病变异，以及染色体核型分析检测11p15.5染色体倒位或易位。
注：BWS：Beckwith-Wiedemann综合征（Beckwith-Wiedemann syndrome）
胎儿产前影像学检查可疑BWS时，应选择合适的遗传学检测方法进行产前诊断。国内已报道多例产前超声或染色体拷贝数异常诊断BWS病例，暂无产前甲基化检查诊断BWS的报道[10,11]。由于缺乏对BWS的诊断经验，本例最初并没有根据胎儿脐膨出和胎盘囊性增厚的超声异常表现而推测胎儿为BWS，只选择了常规遗传检测方法，之后因胎儿SNP array检测发现11p15.5微缺失，提示缺失区域包含KCNQ1 5'端外显子区域，有文献报道KCNQ1 5'端外显子区域杂合缺失可导致甲基化异常引起BWS[7]，遂进一步行MS-MLPA对ICR1、ICR2甲基化检查，最终确诊胎儿为BWS。以往文献报道染色体11p15区域异常导致BWS大都包含ICR2区域，而本病例染色体缺失区域并不包含ICR2区域，只包含KCNQ1 5'端的外显子区域。Beygo等[7]在2016年报道了一例家族性ICR2上游缺失引起ICR2甲基化缺失的产前诊断BWS病例，同样为KCNQ1 5'端外显子区域杂合缺失；并在2019年通过小鼠模型进一步证实了KCNQ1的转录是建立ICR2母体甲基化印记所必需的[12]。本例胎儿也证实了KCNQ1 5'端外显子区域杂合缺失可导致ICR2甲基化缺失。
本例孕妇第1次妊娠胎儿同样表现为脐膨出和胎盘增厚，当时也由于缺乏对本病的认知，被误认为可疑不完全葡萄胎，孕妇拒绝进一步检查，选择终止妊娠。结合此次妊娠超声异常表现，回顾前一次妊娠相似的超声异常表现，高度怀疑孕妇第1胎亦为BWS。为查找可能发生原因，为胎儿父母行SNP array检查和染色体G显带核型分析，判断是否存在同样拷贝数变异、染色体结构重排，结果均未发现异常。虽不能明确诊断孕妇第1胎亦为BWS，但因两胎产前超声表现高度相似，仍怀疑为复发性BWS，高度怀疑为孕妇生殖腺嵌合导致，但由于基因缺失片段小且未发现父母异常，无法行家系单倍体构建，因此不能行胚胎植入前遗传学检测。建议下次妊娠孕早期行超声检查时应注意胎儿脐部和胎盘情况，并行介入性产前诊断，同时应用SNP array与MS-MLPA检测染色体及甲基化。
1980年，Weinstein和Anderson[13]首次通过超声产前诊断1例BWS胎儿。通过总结相关病例，2005年Williams等[14]提出"2个主要标准（腹壁缺损、巨舌症、巨大儿）"或"1个主要标准加2个次要标准（肾肥大/发育不良、肾上腺细胞肥大、非整倍体/异常位点、羊水过多）"的模式，适用于所有已发表的产前诊断BWS的报告。基于欧洲先天性异常监测（European Surveillance of Congenital Anomalies, EUROCAT）登记的数据，Barisic等[15]对产前或生命早期诊断出的BWS患者进行流行病学和临床方面的研究，结果表明BWS胎儿最常见的3个超声表现为巨大儿、腹壁缺损和巨舌，这些表现大部分均在孕晚期发现。本例孕妇的2次妊娠仅在孕早期发现胎儿脐膨出和胎盘囊性增厚，由于孕周较小未发现其他表现，因此认识不足。有文献指出，有10%~20%的BWS胎儿仅表现脐膨出，约20%的胎盘间叶发育不良胎儿最终诊断为BWS[6]。脐膨出胎儿染色体异常的发生率为30%~70%，与坎特雷尔五联征（Pentalogy of Cantrell）和BWS相关[16]。胎盘间叶发育不良产前超声往往表现为胎盘囊性增厚，诊断需通过病理，因其影像学表现与部分性葡萄胎较相像，需注意鉴别诊断[17]。遗憾的是本例胎盘未行病理检查。因多数超声异常表现需在孕中、晚期才能发现，即依靠超声诊断往往孕周较大，建议孕早期超声检查注意胎儿是否存在脐膨出和/或胎盘异常增厚，同时选择合适产前遗传学检测方法，可较早产前诊断出BWS。
综上所述，当产前发现胎儿脐膨出、胎盘囊性增厚、巨舌、生长过度、内脏肥大等影像学表现，应该考虑到BWS，选择合适的遗传学检测方法。由于BWS致病机制较多，各种原因影响ICR2、ICR1甲基化均可导致BWS，因此选择合适的遗传学检测方法至关重要。有专家共识建议将ICR1和ICR2甲基化检查作为BWS一线分子检查[6]。BWS产前诊断病例非常少见。由于甲基化检测不属于常规产前诊断技术，期望本病例能增强临床医生对BWS的认识，当临床怀疑胎儿为BWS时，建议在常规产前诊断的基础上选择MS-MLPA进行甲基化检测，以提高BWS的检出率。
所有作者均声明不存在利益冲突
