急性淋巴细胞白血病(ALL)是儿童最常见的恶性血液肿瘤。6-巯嘌呤(6-MP)是ALL患儿维持治疗期采用的核心药物，其不良反应主要为骨髓抑制及肝不良反应，严重不良反应的发生可能导致患儿治疗被中断或者继发感染等。6-MP治疗维持治疗期ALL患儿导致的不良反应具有显著个体差异，临床医师如何平衡其过程中的风险与收益，以及基于其药物基因组及代谢产物水平调整6-MP剂量，已成为相关研究热点。为了指导维持治疗期ALL患儿6-MP的临床用药方案调整，笔者拟就6-MP的不良反应与其代谢产物、药物基因多态性间的关系，以及个体化用药等方面的研究现状进行介绍。
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急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia, ALL)是儿童最常见的恶性血液系统肿瘤，约占儿童肿瘤的1/3。随着对ALL基因组学研究的深入，以及相关治疗方案的改进，ALL患儿的5年总体生存(overall survival，OS)率接近90%[1]。我国一项回顾性研究，对1 085例维持治疗期ALL患儿采取上海儿童医学中心(Shanghai Children′s Medical Center，SCMC)-ALL-2005方案进行治疗的结果显示，其5年OS率达80%[2]。
6-巯嘌呤(6-mercaptopurine, 6-MP)是维持治疗期ALL患儿的核心治疗药物，长时间持续口服6-MP是维持治疗方案的重要组成部分，6-MP在减少疾病复发和改善患儿预后方面具有重要作用[3]。但是6-MP的体内代谢通路及代谢产物复杂，容易引起患儿发生骨髓抑制、肝功能损伤等严重不良反应。而且6-MP导致不良反应的发生具有明显的个体化差异[4,5,6]。近年来，多项药物基因组学研究结果证实，某些特定基因变异与6-MP不良反应的发生有关，如巯嘌呤甲基转移酶(thiopurine methyltransferase，TPMT)，核苷二磷酸连接部分X型基序(nucleoside diphophate-linked moiety X-type motif，NUDT)15等基因多态性，均与ALL患儿对6-MP的耐受剂量相关，这为6-MP个体化治疗方案提供理论依据[5]。对于治疗过程中6-MP代谢产物的监测，可进一步为6-MP的剂量调整提供依据。笔者将主要阐述6-MP所引起的不良反应，以及如何更好地调整药物剂量实现个体化精准医疗，从而指导维持治疗期ALL患儿临床治疗，提高其生存率。
6-MP是嘌呤类衍生物，其结构与次黄嘌呤类似。6-MP在人体内的代谢途径十分复杂，多种酶参与其中。6-MP主要的代谢途径包括3种[7]。① 6-MP经黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase, XO)催化形成6-硫尿酸，后者作为无活性代谢产物经肾排出体外。② 6-MP经巯嘌呤甲基转移酶(thiopurine methyltransferase, TPMT)催化形成甲基化产物，如6-甲基硫嘌呤(6-methylmercaptopurine, 6-MMP)，6-甲基化巯基次黄嘌呤核苷磷酸盐(6-methylmercaptopurine nucleotides, 6-MMPN)，甲基化过程中的甲基由叶酸循环产生的S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl methionine, SAM)提供。③ 6-MP经次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase，HGPRT)作用，转化为6-巯基次黄嘌呤核苷单磷酸(6-thio-inosine monophosphate, 6-TIMP)，再经次黄嘌呤单磷酸脱氢酶(inosine monophosphate dehydrogenase, IMPDH)脱氢，鸟嘌呤核苷一磷酸脱氢酶(guanosine monophosphate synthetase, GMPS)磷酸化，最终形成6-硫鸟苷酸(6-thioguanine nucleotides, 6-TGN)，6-TGN可以与胸腺嘧啶配对，形成DNA结合的硫鸟嘌呤核苷酸(DNA incorporated thioguanine nucleotides，DNA-TG)，触发错配修复机制，导致细胞凋亡。
6-MP代谢通路复杂，可产生多种引起不良反应的代谢产物，导致ALL患儿出现白细胞和血小板减少，严重者可出现造血抑制。此外，6-MP还可导致胃、肠道不良反应，如恶心、胰腺炎，以及肝功能损伤、低血糖等。6-MP的代谢产物6-TGN可以插入DNA中，导致细胞凋亡。这既是6-MP治疗ALL的主要机制，同时也是其引起血液系统不良反应的重要原因。患儿一旦出现严重的白细胞减少，严重感染的风险增加，而感染所致的化疗中断，可能造成其复发风险增加[8]。同时，研究发现，高6-TGN水平可增加ALL患儿第二肿瘤发生风险(P＝0.02)[9]。6-MP的甲基化代谢产物6-MMPN是嘌呤从头合成途径的抑制物，也可能促进DNA-TG的形成[10]。此外，6-MP的甲基化代谢产物(6-MMPN、6-MMP)和肝功能损害及低血糖不良反应有关[11,12]。肝功能异常是6-MP治疗过程中常见不良反应，约90% ALL患儿于维持治疗期出现丙氨酸转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)水平升高，但是大部分患儿在停药后，肝功能可迅速恢复至正常水平。患儿接受6-MP维持治疗期，发生空腹低血糖并不罕见，并且其年龄越小(<6岁)越容易发生[13]。由于6-MP空腹口服生物利用率高，因此通常选择晚间顿服给药。临床研究发现，在维持治疗期发生6-MP相关低血糖的患儿中，当改变给药时间为早晨给药或者给药频次为2次/d时，患儿外周血中6-MMP水平下降，随之血清ALT水平下降，低血糖症状也得到改善[10,13]。此外，有研究发现，高浓度的6-MMP与胰腺炎的发生有关，但具体机制还需研究[14]。6-MP复杂代谢通路导致的众多不良反应，极大地增加了ALL患儿维持治疗期6-MP用药调整的难度。
6-MP代谢过程中涉及多种催化酶，编码这些酶的基因变异所致酶活性改变影响其药理作用。TPMT是目前研究最多的6-MP代谢相关酶，TPMT活性在人群中具有显著个体差异，并且TPMT活性与6-MP代谢密切相关。TPMT可以使6-MP甲基化，是调节6-MP代谢的重要催化酶。TPMT活性降低导致6-TIMP及其下游代谢产物6-TGN增加，从而发挥对白血病细胞的杀伤作用，以及对造血功能的抑制作用。TPMT主要有4种基因突变型，包括TPMT*3A、TPMT*3C、TPMT*2及TPMT*3B。而前3种TPMT基因突变型可导致蛋白不稳定和TPMT降解增强，并与90%的TPMT活性降低有关，是最常见的导致TPMT失活的基因突变，亚裔人群以TPMT*3C多见[15]。Higgs等[16]对既往67项针对ALL患者TMPT基因型和6-MP治疗不良反应的研究进行回顾性系统分析发现，伴2个TPMT基因突变，即TPMT无活性患者的骨髓不良反应发生率为86%(37/43)。与不伴TPMT基因突变患者相比，伴1个TPMT基因杂合突变患者的白细胞减少发生率增加(OR＝4.19，95%CI：3.20～5.48)。研究结果显示，接受北欧儿童血液学和肿瘤学学会(Nordic Society of Pediatric Hematology and Oncology，NOPHO)ALL-92方案治疗的ALL患儿中，伴TPMT基因杂合突变及TPMT无活性患儿(n＝75)复发率低于不伴TPMT基因突变患儿(n＝526)[(18±2)%比(7±3)%，P＝0.03]，但是生存率(90%比90%，P＝0.82)，第二肿瘤发生率没有显著改善(5%比2%，P＝0.07)[17]。这可能与TMPT基因杂合突变患儿红细胞内6-TGN水平增高有关。研究发现，与ALL-92方案(n＝75)相比，接受减低初始剂量6-MP(由75 mg/m2减低至50 mg/m2)治疗的伴TMPT基因杂合突变患儿(n＝56)的第二肿瘤发生率降低(5%比0，P＝0.03) ，但是复发率升高[6.7%(95%CI：2.9%～15.5%)比19.7%(95%CI：11.6%～33.3%),P＝0.03][18]。如何维持TPMT低活性ALL患儿较低的复发率，并降低其第二肿瘤发生率是目前研究的难点，有待进一步深入探讨。
仅TPMT基因多态性并不能完全解释6-MP相关不良反应的个体差异。有研究结果表明，225例中国汉族健康人群中，仅6例为TPMT*3C杂合子，汉族健康人群TPMT基因突变频率仅为1.33%(6/450)[19]，低于欧美国家(5%～10%)[20]。并且研究发现，部分TPMT活性正常的ALL患儿仍然可能发生6-MP相关不良反应[4]。最近，全基因组关联研究(genome-wide association studies，GWAS)结果表明，Nudix水解酶超家族成员NUDT15错义突变c.415C>T(rs116855232)与6-MP不良反应显著相关(P<0.001)[21]，而且东亚人群的rs116855232突变频率高(9.8%)[21]。NUDT15是针对细胞内DNA损伤的保护机制之一，其可以使6-MP的代谢产物去磷酸化，从而阻止其插入DNA链。研究发现，经6-MP处理后，NUDT15基因敲除人淋巴细胞中TGTP、DNA-TG水平均显著高于人淋巴细胞(P<0.05)[22]。这表明，在NUDT15基因敲除人淋巴细胞中6-MP代谢向TGTP偏移。同样，NUDT15基因突变使NUDT15活性降低，6-TGTP、6-dTGTP水平增高，从而导致ALL患儿6-MP相关骨髓抑制增强[6]。因此，NUDT15低活性ALL患儿在接受标准剂量6-MP治疗时严重骨髓不良反应发生率更高，在NUDT15低活性ALL患儿接受6-MP治疗过程中临床医师应特别注意预防骨髓不良反应。
目前，文献报道，NUDT15基因突变多达19种[5]，其中研究最为广泛的3号外显子突变c．415C>T(rs116855232)，根据其突变情况分为野生型(C/C)、杂合型(C/T)及纯合型(T/T)。韩勇等[23]纳入105例中国ALL患儿，对与6-MP药物代谢有关的3种基因突变NUDT15 rs116855232、TPMT rs1142345及核苷三磷酸(inosine triphosphatase，ITPA)rs11273540进行比较的研究发现，NUDT15 rs116855232基因突变是ALL患儿白细胞减少[白细胞计数(white blood cell count，WBC)<2.0×109/L]的重要标志(OR＝3.62，95%CI：1.377～9.501，P＝0.009)。韩国一项纳入182例维持治疗期ALL患儿的研究发现，与NUDT15中等活性组(n＝46)及正常活性组(n＝131)相比，NUDT15低活性组(n＝5)患儿第1年治疗中断时间最长(30 d比16 d比169 d，P<0.01)，也表现出较长的白细胞减少时间(92 d比59 d比131 d，P<0.01)，并且低活性组6-TGN水平与6-MP剂量比值最低(13.3±7.5比14.7±9.1比4.4±2.7，P<0.001)[4]。此外，日本一项关于6-MP不良反应的研究发现，NUDT15基因突变与ALL患儿维持治疗期肝功能损伤相关[21]。综上，鉴于NUDT15基因型与东亚人群的6-MP耐受剂量及不良反应密切相关，在ALL患儿维持治疗期，6-MP用药前有必要进行NUDT15基因型检测。
6-MP代谢的个体差异也可能涉及其他酶，其中ITPA是研究热点之一。ITPA活性缺乏可导致患儿6-巯基次黄嘌呤核苷三磷酸(6-thio-inosinetriphosphate，6-TITP)毒性蓄积，进而产生骨髓抑制，其中亚洲人群的ITPA 94C>A基因突变频率高达15%[24]。但是，目前ITPA基因多态性与6-MP的耐受剂量及其诱导的不良反应之间的关系尚存争议[23,25]。这一方面可能和各队列研究纳入的人群不同，也可能和回顾性研究数据采集不够准确有关，但至少可以认为与TPMT、NUDT15基因突变相比，ITPA 94C>A基因突变对ALL患儿6-MP耐受剂量的影响较小。脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶(apyrimidinic endodeoxyribonuclease，APEX)1是DNA损伤修复的DNA碱基切除修复(base excision repair，BER)途径中的主要酶。韩国一项关于儿童ALL的研究发现，APEX1 rs2307486基因突变增加了ALL患儿发生6-MP相关早期中性粒细胞缺乏的风险(OR＝3.44，P＝0.02)[26]。也有文献报道，ATP结合盒转运蛋白超家族(ATP-binding cassette transporter family class，ABC)C4基因多态性与6-MP不良反应有关[20]。但是这些基因与6-MP的耐受剂量及其不良反应的相关性，均需更大规模的队列研究进一步验证。
临床研究NOPHO ALL-92结果显示，维持治疗期平均绝对中性粒细胞计数(absolute neutrophil count，ANC)≤2.0×109/L的ALL患儿(n＝280)复发率显著低于平均ANC高于此值者(n＝248)(P<0.001)[27]。但是严重的白细胞减少，可能引起严重感染，甚至导致治疗中断，引起ALL复发。相关研究者正在探索如何平衡6-MP的疗效及其不良反应。目前，中国儿童癌症协作组(Chinese Children Cancer Group，CCCG)-ALL-2015方案要求患儿维持治疗期WBC维持在(2.0～3.5)×109/L之间。临床医师可根据ALL患儿的WBC、ANC调整6-MP剂量，然而6-MP维持治疗期不良反应多样，并且具有显著个体差异，对于不同患儿，相同的WBC和ANC不一定反映相同的骨髓抑制水平。其次，对于部分发生不良反应，如肝功能损伤的患儿，其WBC通常可维持在正常水平。维持治疗期地塞米松及长春新碱的使用也会影响患儿WBC，上述影响因素均增加对6-MP的剂量调整难度。因此，探索更精准的6-MP剂量调整标志物，有利于ALL患儿的个体化治疗开展，如基于6-MP代谢相关基因型及6-MP代谢产物的药物剂量调整。
6-MP的代谢具有显著个体差异，根据个体TPMT或者NUDT15等基因型调整6-MP剂量已经显现出一定优势。在治疗前进行TPMT及NUDT15重要基因突变位点检测十分必要，可以精确指导6-MP初始剂量。
2018年，临床药物遗传学执行联合会(Clinical Pharmacogenetics Implementation Consortium，CPIC)为伴TPMT和(或)NUDT15基因突变ALL患儿提供了6-MP剂量的详细指导[28](表1)。对于伴2个丧失功能的TPMT基因纯合突变ALL患儿，由于其6-TGN水平高，若给予常规剂量6-MP，则存在严重骨髓抑制风险。而对于伴TPMT基因杂合突变患儿的6-MP耐受剂量目前尚无共识。尽管在伴TPMT基因杂合突变患儿中，6-MP的代谢产物6-TGN水平比不伴该基因杂合突变高，但是仅伴TPMT基因杂合突变者，不能耐受全剂量6-MP。这可能与其更低的6-MMPN水平有关(6-MMPN是嘌呤从头合成途径的抑制剂)。
基于TPMT和NUDT15基因型的6-MP剂量调整
基于TPMT和NUDT15基因型的6-MP剂量调整
| 等位基因 | 代谢特点 | 骨髓抑制风险等级 | 剂量调整 |
|---|---|---|---|
| 2个功能正常的TPMT等位基因：*1/*1 | TPMT活性正常(6-TGN浓度低，MeTIMP浓度高) | 低风险 | 75 mg/(m2·d) |
| 2个功能正常的NUDT等位基因：*1/*1 | NUDT15活性正常 | ||
| 1个功能正常和1个无功能的TPMT等位基因：*1/*2、*1/*3A、*1/*3B、*1/*3C、*1/*4 | TPMT活性中等(6-TGN浓度中等及高、6-MeTIMP浓度低) | 较高风险 | 标准剂量的30%～80% |
| 1个功能正常和1个无功能的NUDT15等位基因：*1/*2、*1/*3 | |||
| 1个不确定功能和1个无功能的NUDT15等位基因：*2/*5、*3/*6 | NUDT15活性中等 | ||
| 2个无功能的TPMT等位基因：*3A/*2、*3A/*3C、*3A/*4、*2/*3C、*2/*4、*3C/*4 | TPMT无活性(6-TGN浓度极高，无MeTIMP) | 极高风险 | 标准剂量的10%，给药频次为3次/周 |
| 2个无功能的NUDT15等位基因：*2/*2、*2/*3、*3/*3 | NUDT15无活性 |
注：6-MP为6-硫嘌呤给药，6-MeTIMP为6-甲基化巯基次黄嘌呤单磷酸盐，6-TGN为6-硫鸟苷酸，TPMT为巯嘌呤甲基转移酶，NUDT为核苷二磷酸连接部分X型基序
NUDT15 c．415C>T(rs116855232)基因突变是目前研究最为广泛的6-MP不良反应相关基因突变，该基因突变在东亚地区人群中突变频率最高(9.8%)，可使其所编码NUDT15活性丧失，从而产生严重的骨髓抑制。伴NUDT15 rs116855232纯合突变的ALL患儿仅能耐受6-MP标准剂量的8.3%，而伴杂合突变和野生型患儿分别是63.0%和83.5%[21]。NUDT15基因其他变异类型，大部分十分罕见，对临床指导意义不大。有研究者利用成簇规律性间隔短回文重复序列(clustered regularly interspersed short palindromic repeats，CRISPR)-Cas9基因组编辑技术，建立了NUDT15-/-小鼠模型[29]，在予相同剂量6-MP 20 mg/(kg·d)条件下，NUDT15-/-小鼠(n＝11)比野生型小鼠(n＝10)血液学不良反应更严重，如外周中性粒细胞计数(P＝0.006)、血红蛋白值(P＝0.016)和血小板计数降低(P＝0.016)。研究发现，NUDT15-/-小鼠骨髓组织中6-MP代谢为DNA-TG的效率比野生型小鼠高1.8倍，将NUDT15-/-小鼠的6-MP剂量调整为1 mg/(kg·d)，其骨髓细胞DNA-TG水平与接受全剂量20 mg/(kg·d) 6-MP野生型小鼠的DNA-TG水平相当(P>0.05)。研究还发现，在没有采用6-MP治疗的情况下，携带白血病致病基因的NUDT15-/-(n＝14)和野生型小鼠(n＝14)无白血病生存(leukemia-free survival，LFS)率相近(P>0.05)；予低剂量1 mg/(kg·d)的6-MP治疗条件下，野生型小鼠(n＝10)仅出现了疾病进展的延迟，而NUDT15-/-小鼠(n＝10)未发生白血病。由此推测，在伴NUDT15基因突变ALL患儿中，合理降低6-MP剂量，不仅可以避免DNA-TG累积所致严重骨髓抑制，同时可能并不影响其抗白血病疗效。
6-MP的半衰期短(1～2 h)，口服后红细胞内6-TGN即可达到稳定浓度。研究发现，红细胞内6-MMPN浓度与6-MP剂量呈正相关关系(P<0.001)，白细胞内DNA-TG与红细胞内6-TGN、6-甲基化MP浓度均呈相关关系(P<0.001)[30]。6-MP的代谢产物可以作为6-MP剂量调整的标志物。目前通常使用6-MMPN/6-TGN作为6-MP代谢偏倚(skewed metabolism)的指标，即使在未发生6-MP相关不良反应的情况下，6-MMPN/6-TGN>20被认为是6-MP治疗效率低下[31,32]。针对ALL患儿的一项研究结果表明，接受6-MP治疗后，未发生肝不良反应患儿(n＝10)的平均6-MMPN水平显著低于发生肝不良反应者(n＝56)(P＝0.006)；6-MMPN水平>5 000 pmol/8×108红细胞时，接受6-MP治疗ALL患儿的肝不良反应发生风险增加(该指标特异度为80%，敏感度为80.4%)[33]。发生严重肝不良反应时，通常可以减停6-MP；此外，目前别嘌醇和减低剂量6-MP联合应用于ALL维持治疗期也取得良好的效果。别嘌醇是黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase，XO)抑制剂，对TPMT具有抑制作用，可以使6-MP的代谢向6-TGN方向偏移，从而减少肝不良反应的发生，并增强疗效。2020年，Stuckert等[34]纳入19例发生6-MP代谢偏倚的ALL患儿(即6-MMPN/6-TGN>20，伴肝不良反应患儿的ANC>1 500/μL)，予减低剂量6-MP。初步研究结果显示，联合应用别嘌醇8周后6-MMPN及肝酶水平显著下降，ANC维持在< 1 500/μL。此外，有个案报道显示，可以通过减低剂量6-MP联合别嘌醇减少6-MMP的产生，改善ALL患儿低血糖症状[35,36]。
最近，Stine等[37]采用NOPHO ALL2008方案，即6-MP起始剂量为75 mg/(m2·d)[伴TPMT基因杂合突变患儿为50 mg/(m2·d)，TPMT无活性患儿为10 mg/(m2·d)]治疗918例非高危ALL患儿，测定其维持治疗期DNA-TG及红细胞内6-TGN、6-MMP及甲氨蝶呤多聚谷氨酸(methotrexate polyglutamates，MTXpg)2～6浓度发现，DNA-TG浓度与患儿累积复发率呈负相关关系(HR＝0.81，95%CI：0.67～0.98，P＝0.029)，特别是在微小残留病(minimal residual disease，MRD)呈阳性的患儿中(HR＝0.72，95%CI: 0.67～0.98，P＝0.006 5)；在918例非高危患儿中，9例罹患第二肿瘤[第二肿瘤发生中位时间为840 d(561～1 630 d)]，而第二肿瘤的发生与DNA-TGN水平无关(HR＝1.05，95%CI：0.75～1.5;P＝0.80)。DNA-TG水平与ALL患儿生存率呈正相关关系，但尚无明确截断值，而且目前尚无随机对照临床试验结果支持可通过检测6-MP代谢产物(DNA-TG)调整6-MP剂量。6-MP的治疗时间长达2～3年，治疗过程中6-MP代谢产物监测为6-MP的剂量调整提供依据，并可能改善ALL患儿预后。
综上所述，6-MP的不良反应与其代谢产物密切相关，并且具有显著的个体差异。随着ALL诊断中二代基因测序技术的普及，NUDT15、TPMT基因型可以在ALL遗传学分型时一并检出，这将为6-MP的精准用药提供前提。同时，代谢产物，如6-TGN及6-MMPN等的浓度监测使得6-MP剂量进一步个体化，从而优化疗效，并且降低不良反应。但是，基于6-MP代谢产物水平的6-MP剂量调整是否优于以WBC为基础的剂量调整方案，需要随机对照临床试验予以证实。此外，其他基因，如ABCC4，脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶(apyrimidinic endodeoxyribonuclease，APEX)1等基因多态性是否与ALL患儿对6-MP的耐受性及不良反应相关，有待进一步研究证实。
所有作者均声明不存在利益冲突
