异基因造血干细胞移植(allogenic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT)是目前急性髓性白血病(acute myeloid leukemia，AML)唯一可能的治愈方法。但allo-HSCT后大约有30%~40%的受者会出现复发，是其主要死亡原因之一。复发可能不是克隆演变所致，而是白血病细胞通过多种机制造成的免疫逃逸，以逃脱机体的免疫杀伤作用，其中包括人类白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)分子表达的改变，抗炎细胞因子的产生，以及免疫检查点(immune checkpoint，ICP)抑制物的表达等。本研究尝试通过回顾免疫逃逸的主要机制，探讨克服这些潜在机制的策略。
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急性髓性白血病(acute myeloid leukemia，AML)是成人最常见的急性白血病类型。近年来，学术界对于AML分子遗传学方面的研究发展迅速，为新的治疗策略开辟了道路。但相关研究表明，异基因造血干细胞移植(allogenic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT)仍然是AML唯一可能的治愈方法[1]。allo-HSCT后复发是AML患者一个主要的并发症，大约30%~40%的患者会出现复发[2,3]。因此，现阶段的首要任务是开发更有效的治疗方法降低复发率，提高受者存活率。在allo-HSCT后出现复发的AML患者中，有将近一半发生在移植术后6个月内，此时受者仍在接受免疫抑制治疗，在某些临床条件下将免疫抑制剂快速减量，可能可以通过所谓的移植物抗白血病反应(graft versus leukemia reaction，GVLR)重新诱导缓解[4]。这一临床治疗方法的原理是基于allo-HSCT是一种免疫治疗形式，宿主抗原提呈细胞(antigen-presenting cells，APC)和供体T细胞间的相互作用可能可以根除白血病细胞。这一发现为识别和揭示其他新的潜在免疫逃逸机制铺平了道路。另外的一些证据也表明，复发可能不是由于克隆进化所致，而是由于白血病细胞通过多种机制造成的免疫逃逸，包括人类白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)分子表达地改变、抗炎细胞因子的产生、相关代谢的变化以及免疫检查点(immune checkpoint，ICP)抑制物的表达，这些抑制物能够"关闭"对白血病细胞的免疫反应[5,6]。本研究将通过复习文献，回顾免疫逃逸的主要机制，并探讨克服这些潜在机制的策略。
2009年，Vago等[7]首次在单倍型造血干细胞移植(haploidentical hematopoietic stem cell transplantation，haplo-HSCT)受者中发现了不匹配的HLA基因组的丢失(也被称为"HLA丢失")。当时他们正在研究HLA配型是否可以作为评估造血嵌合状态的另一种技术，遇到了几例AML移植后复发的病例，并通过从这些复发者中提纯的白血病细胞基因组的HLA分型证实，在受者不匹配的特异性HLA单体上，所有的HLA Ⅰ类和Ⅱ类基因都不存在。然后利用全基因组单核苷酸多态性(single-nucleotide polymorphism，SNP)阵列对这一现象进行了更深入的研究，发现在没有拷贝数变异(copy number variations，CNVs)的情况下，6号染色体长臂会出现杂合性丢失(loss of heterozygosity，LOH)，证实可能存在获得性体细胞单亲二体(uniparental disomy，UPD)[5]。这种染色体改变是指来自父方或母方的染色体区域/片段被另一方的同源部分取代，或一个个体的2条同源染色体都来自同一亲本而导致杂合性丢失，导致该区域获得纯合性[8,9]。UPD现已被描述为一种存在于不同类型的肿瘤中常见染色体畸变，包括实体肿瘤和血液肿瘤。
在过去的十年中，随着多种临床药物及相关辅助技术的发展，大量部分HLA不相合的T细胞已经能够从供者安全地转移到受者身上，大大降低了haplo-HSCT的毒性。对于需要allo-HSCT但没有完全匹配供者的受者，haplo-HSCT无疑是一种有效选择。移植物抗宿主病(graft versus-host disease，GVHD)和GVLR都依赖于T细胞同种异体反应性，即供者的T细胞识别和靶向对抗非自身抗原的能力。GVLR的核心机制是识别白血病干细胞(Leukemic Stem Cells)提呈的不匹配的HLA分子，在haplo-HSCT中，供者和受者间显著的基因组差异本可促成AML患者的长期无复发生存(relapse free survival，RFS)[10]，但移植后复发的发生率并没有随之下降，受者白血病干细胞基因组中不匹配的HLA丢失成为了逃避供者T细胞同种异体反应的有效机制。不匹配的HLA分子的丢失是通过拷贝中性杂合性丢失(copy-neutral loss of heterozygosity，CN-LOH)发生的，CN-LOH也常被称为UPD，这种机制消除了不匹配的HLA等位基因，同时不会降低HLAⅠ类分子的表达水平[11]。在单倍型相合和HLA不相合的allo-HSCT中，可能超过三分之一的复发是由"HLA丢失"引起的。
最近有2项研究指出，HLA分子的丢失并不是白血病细胞用来逃避供体来源T细胞识别的唯一策略[6,11]。研究者在对移植前后的样本进行成对比较后发现，有高达40%的移植后复发受者的HLAⅡ类分子(HLA-DR、-DQ和-DP)几乎不再在细胞表面表达，这类细胞转化为了供者T细胞不能识别的复发细胞群[11]。在这种情况下，向移植物中注入更高剂量的T细胞可能加速这种复发方式的发生。与单倍型丢失不同的是，到目前为止，在HLA相合和不全相合的移植中，HLAⅡ类基因下调的频率相似[6,11]。值得注意的是，在对复发白血病基因的全外显子测序分析中，没有发现HLA基因及其调节因子突变的证据，而通过转录组测序技术(RNA sequencing，RNA-seq)分析可发现HLAⅡ类基因(HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DQB1和HLA-DRB1)的表达在复发时下调，其水平比初诊时的配对样本低3~12倍[6]。这两项首次将HLAⅡ类基因下调描述为一种免疫逃逸方式的研究对复发白血病基因进行了深入分析，但并未发现HLA基因或其调节因子突变的证据，这进一步证明了所观察到的现象可能是表观遗传学的起源。
但Toffalori等[12]将供者来源的T细胞注入HLAⅡ类基因缺陷的动物中后发现，尽管速度较慢，白血病细胞最终还是被T细胞识别和根除。他们对这一现象进一步深入研究，发现输注的T细胞和小鼠抗原的交叉识别会导致动物血浆中出现高水平的γ干扰素(interferon-γ，IFN-γ)，随后白血病细胞上的HLAⅡ类分子表达恢复[13]。这一结果证实了去甲基化药物(hypomethylating agents，HMA)，如5-氮杂胞苷(5-azacitidine，AZA)、地西他滨在预防和治疗移植后复发方面的有效性[14]。
细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白-4(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein-4，CTLA-4)和程序性死亡-1(programmed death-1，PD-1)是负向调节T细胞免疫功能的2个重要ICP。同种免疫T细胞功能的缺乏或降低的原因之一可能是T细胞的耗竭[15]。而T细胞的耗竭与抑制性检查点[PD-1、T细胞免疫球蛋白粘蛋白-3(T-cell immunoglobulin mucin-3，TIM-3)等]的表达增加相关[16,17]。有研究分析了抑制性检查点在allo-HSCT后复发背景下的表达，发现在移植后早期(移植后100 d内)，PD-1在T细胞上普遍过表达[18]。另外，Hutten等[19]的研究发现，PD-1、T细胞免疫球蛋白与免疫受体酪氨酸抑制模体(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif，ITIM)结构域(T cell immunoglobulin and ITIM domains，TIGIT)和杀伤细胞凝集素样受体亚家族成员-1(killer cell lectin-like receptor subfamily member 1，KLRG-1)在反应性CD8+ T细胞上的高表达与allo-HSCT后的复发相关。另外，Schade等[20]发现，allo-HSCT后早期CD4+ T细胞上PD-1表达上调也与受者病死率上升相关。
(1)细胞因子的作用：白血病细胞可以通过产生细胞因子逃脱免疫监视。从正常髓系祖细胞释放的大量白细胞介素-15(interleukin-15，IL-15)可以通过增强T细胞对白血病细胞的同种异体反应性，促进NK细胞增殖，从而杀伤肿瘤细胞。低水平的IL-15和白细胞介素-17(interleukin-17，IL-17)，特别是在移植后早期(移植后100 d内)，与较低的急性GVHD发生风险和较高的复发风险相关[21]。此外，在动物模型中的研究表明，FMS样酪氨酸激酶3(FMS-like tyrosine kinase 3，FLT3)的内部串联重复(internal tandem duplication，ITD)通过抑制其主要转录调节因子，干扰素调节因子7(interferon regulatory factor 7，IRF7)，负调控IL-15相关基因的转录[22]。因此，携带FLT3-ITD突变的AML细胞表达IL-15基因的水平非常低。FLT3抑制剂的作用机制主要通过恢复IL-15的表达来抵消IRF7的激活阻滞。因此，FLT3抑制剂协同T细胞输注，可能通过加强肿瘤细胞的清除而有利于长期的疾病控制[22]。
(2)逃避NK细胞识别和破坏：最近的研究表明，一些能激活NK细胞的受体或配体的下调以及抑制NK细胞活化受体的激活可能通过促进AML细胞来逃避NK细胞的识别[23]。白血病细胞可能通过激活编码NKG2D配体(NKG2D ligand，NKG2DL)的基因，如MICA、ULBP1、ULBP2和ULBP3基因，使其异常超甲基化来减少NK细胞配体的表达，也可能通过释放可溶性的NKG2DL来诱导NKG2D受体的下调[23]。此外，AML细胞表面存在可与NK细胞激活受体相结合的配体(即CD112和CD155)，可以通过与NK细胞的相互作用而降低包括dNaM-1、NKp30在内的一些NK细胞激活受体的表达。有研究发现，65岁以下AML患者的白血病细胞可能表达高水平的CD112和CD155，从而导致NK细胞上dNaM-1的表达减少，最终使得NK细胞对于AML中白血病细胞的杀伤作用减弱[24,25]。因此，这些激活受体的表达减少对于AML患者的不良预后相关[26,27]。
另外，AML逃脱NK识别，可能要归功于共抑制受体的高表达，包括T细胞免疫球蛋白和免疫受体酪氨酸抑制基序(immune-receptor tyrosine-based inhibitory motif，ITIM)结构域(T cell immunoglobulin and ITIM domain，TIGIT)，TIGHT可通过减少IFN-γ释放来抑制NK细胞活性，可能起免疫检查点的作用。目前，在接受allo-HSCT的AML患者中，移植时TIGIT的高表达与骨髓中NK细胞的数量减少有关；在移植后的随访中，TIGIT的高表达与急性GVHD、不良的总生存时间(overall survival，OS)和无进展生存时间(progress free survive，EFS)的发生率降低相关[28]。
治疗allo-HSCT后复发的理想策略应是一方面能直接发挥抗肿瘤效应，另一方面又能增强供体T细胞的同种异体反应性GVLR，同时避免引起显著的血细胞减少、免疫抑制或GVHD。目前allo-HSCT后复发的最新治疗方式，及分类如下：
allo-HSCT后诱发GVLR最简单、最直观的方法之一就是供者淋巴细胞输注(donor lymphocyte infusions，DLI)。这一策略的主要优点是能够诱导多克隆T细胞反应，能够针对恶性肿瘤细胞上的多个抗原，降低仅因丢失单一抗原而逃脱T细胞识别的风险。DLI的主要缺点是供者T细胞识别和攻击非造血组织的可能性，存在触发GVHD的风险，这可能是一种严重甚至致命的并发症。这种风险或许可以通过输注具有较低同种异体反应性的特定T细胞亚群，如记忆T细胞或γδT细胞来降低[29,30,31]。
当考虑使用DLI治疗移植后复发时，首先要快速确定复发是否是HLA丢失造成的免疫逃逸，因为当白血病细胞中出现与供体不相合的HLA单倍型的基因组丢失时，供体T细胞输注后在受体内对白血病细胞不产生同种反应性效应，但不影响其对健康组织的识别，使DLI诱导的GVHD的发生风险显著提高。
有研究报道，只有15%~20%的骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndromes，MDS)和AML患者对DLI有反应，而且由于AML细胞存在易变性，这些反应持续的时间都很短[7]。导致AML患者DLI疗效降低的其他潜在机制包括：白血病细胞表面缺乏共刺激分子的表达、肿瘤抗原呈递缺陷、HLA分子和主要或次要组织相容性抗原的下调、外周血调节性T细胞(T regulatory cells，Treg)的抑制和NK细胞反应的抑制。最近有研究者发现DLI在联合化疗或与AZA联用时，可能仅对分子学复发、存在有利的细胞遗传学、移植后复发超过5个月的AML/MDS患者有效，因此质疑DLI是否是HSCT后复发的MDS/AML受者的恰当选择[7]。在一项包含20例AML移植后复发患者的DLI研究中，使用了中位CD3+细胞数量为0.6×108/kg的供者T细胞，结果严重的急性GVHD和显著的慢性GVHD的发生率分别为30%和64%[32]。最近，Zeidan等[33]回顾性分析了40例运用DLI治疗的移植后复发患者(包括AML、淋巴瘤、多发性骨髓瘤等)，结果显示完全缓解(complete remission，CR)率为30%，Ⅲ~Ⅳ级急性GVHD或慢性GVHD的发生率分别为15%和8%，并且作者认为对于患者来说，(CD3+细胞数量为1×106/kg体重)可以作为一个合理的DLI起始剂量。
近年来，将第2次同种异体造血干细胞移植用于治疗第1次allo-HSCT后复发的病例逐年增多，这要归功于降低强度预处理和支持治疗的不断优化减少了二次移植之后的毒性。一个对2632例二次移植受者的回顾性分析指出，二次移植后受者的1年存活率为40%，5年存活率为20%，有15%的受者在5年内存活并无复发[34]。对于AML，相关报道也提出了二次移植后5年总生存率为26%~32%，无复发生存率为25%~28%[35,36]。另一项研究发现，有74%的受者在第2次异基因移植后的第1年内复发或死亡，且第2次移植前的疾病状况是二次移植后长期存活最重要的预测因素，移植前CR状态的受者比非CR状态受者有更多的生存机会[37]。此外，考虑到移植相关毒性、移植后迟发效应和较高的移植相关死亡率，是否进行第2次移植仍存在一定争议[37]。
嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)T细胞在治疗淋巴系统疾病中的巨大成功，使人们对CAR-T细胞治疗在AML中的应用充满了期待。然而在AML中，因为包括白血病细胞也存在正常造血祖细胞上表达的抗原，缺乏疾病特异性靶抗原，CAR-T细胞的识别要困难得多。因此，由于CAR-T细胞对于正常造血组织的毒性，使其对于AML的治疗仍处于研究阶段。目前临床仅报道了一例接受CD33定向CAR-T治疗的复发/难治性AML受者，该例治疗后出现了细胞因子释放综合征(Cytokine Release Syndrome)，经历了严重的全血细胞减少，并在CAR-T细胞输注9周后复发[38]。CD123可能是另一个合适的靶点，但与CD33一样，可能存在严重的骨髓毒性。然而最近的一项研究表明，在高危MDS的在体外试验中，CD123可以有效区分正常造血干细胞和MDS干细胞，并靶向攻击MDS干细胞[39]。由于有20%的AML患者存在FLT3基因突变，因此尽管FLT3在造血干细胞和多能造血祖细胞上也有表达，FLT3也可能成为另一个潜在的CAR-T靶点[40]。目前，对于AML的CAR-T治疗还多停留于体外试验阶段，全血细胞的减少、严重细胞因子释放综合征等治疗相关并发症仍然是亟待解决的问题。
树突状细胞(dendritic cells，DC)是一种专职APC，能够摄取、加工和呈递抗原给幼稚的CD4+和CD8+ T细胞，以激活针对抗原的免疫反应。DC通常存在于肿瘤内，与肿瘤细胞密切相关，但由于肿瘤环境能够调节DC的免疫功能导致免疫耐受，它们的抗肿瘤效应很差[41]。为了克服这一问题，学者们开发了基于DC的抗肿瘤疫苗，这种疫苗利用DC主动浸润肿瘤并交叉呈递肿瘤相关抗原(tumor associated antigens，TAA)的能力，激活宿主T细胞和NK细胞。基于DC的疫苗可以通过2种不同的方式获得，2种均为体外方式，首先从患者外周血中获得DC，一种方式是人工装载目标TAA，然后重新注入患者体内。然而，由于所选抗原的免疫原性差，肿瘤细胞能够下调特定抗原的表达，从而导致免疫逃避，这种方法在临床上通常无效。为了克服这些缺点，另一种基于整个肿瘤细胞体外DC激活的新方法也已被开发出来[42]。这种方法的合理性在于免疫激活不是局限于单一抗原，而是针对更广泛的抗原。DC疫苗已被评估为allo-HSCT后AML复发的一种预防性治疗。在最近的一项一期临床试验中，allo-HSCT后早期分子学复发的AML受者被随机分配到2组中，一组接受DLI，另一组接受来自自体外周血单核细胞来源的多基因修饰树突状细胞(multi-genetically modified DCs derived from autologous peripheral blood monocytes，moDCs)的免疫治疗；结果发现moDCs的安全性很高，且该组受者三年OS为48.9%，而DLI组为27.5%；接受moDCs的治疗者中有57%(13/23)获得CR，接受DLI的治疗者中有48%(12/25)获得CR，表明moDCs在白血病细胞负荷不高的情况下疗效较好[43]。
酪氨酸激酶抑制剂(Tyrosine Kinase Inhibitors)是一种具有靶向抗肿瘤作用的药物。近年来，越来越多的证据表明，它们除了直接作用外，其中一些还可以调节免疫效应[44]。最近一项测试酪氨酸激酶抑制剂(索拉非尼)在小鼠白血病模型中作用的研究表明，索拉非尼会使携带FLT3-ITD的白血病细胞产生更多的IL-15，这促进了CD8+ T细胞的活化并增强了GVLR，并最终根除了白血病细胞[45]。酪氨酸激酶抑制剂发挥"靶外"免疫机制的另一个例子是伊马替尼。在慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia，CML)和Ph+急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblasticleukemia，ALL)中，除了靶向杀伤BCR-ABL1融合基因和KIT癌基因产物外，伊马替尼还会调节不同亚群的髓样和淋巴样细胞的增殖分化功能，这种调节既可以抑制肿瘤细胞生长，也可以起到加强免疫的作用[46]。目前，其他新的FLT3酪氨酸激酶抑制剂如奎扎替尼、吉列替尼等的临床应用价值也正在研究中。
由于甲基化是表观遗传调控基因表达的关键过程，恶性肿瘤细胞可利用超甲基化来关闭与细胞凋亡和生长抑制有关的各种基因的表达。HMA可通过抑制DNA甲基转移酶来诱导细胞周期停滞，调节细胞分化和细胞生长。目前，AZA和地西他滨这2种HMA已被广泛用于治疗MDS、AML以及HSCT后复发的治疗[47]。另有部分研究报道，HMA可以上调HLA分子和肿瘤相关抗原的表达，从而增强allo-HSCT后供体T细胞识别和靶向杀伤肿瘤细胞的能力[36]。两项回顾性研究分析了AZA联合DLI治疗MDS和AML移植后复发的疗效，结果显示MDS和AML患者的CR率分别为27%、15%，这说明对于那些复发时疾病负荷较低(分子学复发或骨髓原始细胞<20%)以及从allo-HSCT到复发间隔时间较长者，可从联合治疗中获益更多[48,49]。
组蛋白去乙酰化是基因表达调控的另一种表观遗传学机制，由组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases，HDAC)来执行。HDAC抑制剂通过解开与组蛋白结合的DNA来上调基因表达。在接受allo-HSCT的受者中，这一现象会导致参与炎症因子所产生的基因表达减少，CD4+Treg数量增加，从而阻止GVHD的发展。
由于肿瘤细胞可上调抑制性ICP的表达以逃脱免疫监视，故有学者认为ICP抑制剂会增强allo-HSCT后的GVLR，目前这一药理效应已在各种实体肿瘤和淋巴瘤中广泛应用[50]。程序性死亡受体1/程序性死亡配体1(programmed death-1/programmed death-ligand 1，PD-1/PD-L1)和细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(cytotoxic T lymphocyte -associated antigen -4，CTLA-4)单克隆抗体作为ICP抑制剂正在成为治疗移植后复发受者一种有吸引力的选择，它通过增强同种异体反应性T细胞功能，重塑免疫环境。但考虑到T细胞在GVHD和GVLR中的同种异体反应性，ICP抑制剂在allo-HSCT后的应用仍存在很多问题。多项研究allo-HSCT后ICP抑制剂疗效的临床试验显示，使用抗CTLA-4抗体伊匹木单抗(Ipilimumab)在髓系肿瘤方面有一定前景，而使用PD-1抑制剂在治疗霍奇金淋巴瘤以外疾病中的效果较差[51,52]。此外，移植后使用ICP抑制剂可能引起严重的难治性GVHD以及其他免疫相关事件[53]。在一项探索PD1抑制剂纳武利尤单抗(Nivolumab)和AZA联合治疗复发性AML的Ⅱ期临床试验中，患者对于药物有一定的总应答率(33%)[54]。由于增强和抑制信号的平衡决定了针对肿瘤细胞免疫反应的大小，ICP抑制剂联合HMA可能是一种富有前景的疗法。
综上所述，目前约三分之二的移植后复发可能是由特异的免疫逃逸引起的，移植的成败与我们是否有能力充分利用免疫系统中赋予的许多功能，并将其与靶向治疗相结合，从而减少肿瘤细胞免疫逃逸的机会息息相关。只有建立新的系统来绘制肿瘤免疫靶点，用多组学单细胞技术表征肿瘤免疫微环境，以及建立更为精细的人源化小鼠模型来反映allo-HSCT，对allo-HSCT的免疫生物学进行进一步研究，开发新的药物，方能为每位患者提供最佳的治疗方案。
所有作者声明无利益冲突
