肝移植是治疗终末期肝病的最重要手段^[1]。资料显示，我国每年有30万肝功能衰竭患者等待器官移植，然而，每年器官移植的病例仅有11 000多例^[2]。器官的供需失衡严重制约着肝移植的发展。因此，扩大供肝的来源、提高扩大标准的供者(ECD)供肝的利用率成为改善这一临床困境的重要途径。脂肪变性供肝是最常见的ECD供肝，有资料显示死亡器官捐献者中脂肪变性供肝数量达到30%^[3]。脂肪变性可以分为小泡性和大泡性两种类型。临床上常选择小泡性脂肪变性供肝或者轻度大泡性脂肪变性供肝(大泡性占比<30%)进行移植，而重度大泡性脂肪变性供肝(大泡性占比>60%)可以明显增加移植术后早期肝功能不全(PGD)及早期移植肝无功能(PNF)的风险，提高受者围手术期死亡率，所以不被应用^[4]。中度大泡性脂肪变性供肝(大泡性占比30%~60%)，也就是我们常说的ECD供肝，其使用目前争议较大。数据显示，在排除其他危险因素(包括供者年龄大于40岁、冷缺血时间大于5 h及心脏死亡器官捐献供者供肝等)的情况下，中度脂肪变性供肝的使用可以获得良好的治疗效果^[5]。因此，如何尽可能降低这部分供肝在移植中损伤以达到其最大利用率成为目前肝移植领域研究的热点问题。限于目前医疗技术的发展，肝移植过程中不可避免的会发生缺血再灌注损伤(IRI)，脂肪变性供肝因其不同于正常供肝的病理学特征，所以对IRI的敏感性更高，从而导致PGD及PNF等发生率显著升高，严重影响受者的预后^[6]。因此，我们必须充分了解脂肪变性供肝IRI的发病机制，并制定相应的保护策略，才能提高脂肪变性供肝的利用率。本文就脂肪变性供肝IRI的机制研究进展做一综述。

线粒体是细胞产生能量的场所，它主要是通过氧化磷酸化的过程给细胞提供三磷酸腺苷(ATP)。但是，在缺血状态下，氧化磷酸化的过程受到抑制，ATP只能通过无氧糖酵解产生。这一过程通常不足以满足细胞的能量需求。在再灌注过程中，O₂的重新进入会导致线粒体抗氧化的酶系统-锰超氧化物歧化酶(MnSOD)的活性降低，并导致超氧自由基(O₂^-)的过量产生。大量的O₂^-还可产生过氧亚硝酸盐，进而生成羟基自由基(OH^-)^[7]。这些急剧增加的活性氧(ROS)(包括O₂^-和OH^-)会使细胞发生急性氧化应激反应，损伤线粒体和线粒体外结构(包括细胞内的蛋白质、脂质和DNA)，进一步抑制ATP的产生，影响线粒体内膜的通透性，最终导致细胞死亡^[7]。

研究显示，与正常肝脏相比，大泡性脂肪病变肝脏内的线粒体更容易受到缺血再灌注的损伤，从而产生更多的ROS，导致细胞死亡^[8]。其原因与脂肪肝自身的病理学特征密切相关。首先，脂肪肝中大量游离脂肪酸被转运到线粒体进行β氧化，消耗烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD⁺)和黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)，生成NADH和FADH₂。随着NADH/NAD⁺比值和质子动力势(△P)的增加，O₂^-的产生也随之增加^[9]。其次，脂肪肝中非酯化的胆固醇在线粒体膜上的积累进一步促进了ROS的形成。其原因在于非酯化胆固醇降低了线粒体膜的流动性，并阻碍了抗氧化物谷胱甘肽(GSH)向线粒体基质的转运^[9]，从而导致ROS增加。以上的病理变化在经历缺血再灌注后会变得更加显著，导致ROS成倍增加，最终诱导了肝细胞的死亡。

另有研究表明，瘦素基因缺陷小鼠(Ob/ob小鼠)肝细胞中过度表达线粒体解偶联蛋白-2(UCP-2)也会对线粒体能量代谢过程产生不利影响^[10]。UCP-2定位于线粒体内膜上，它可以引起质子的渗漏，使氧化磷酸化解偶联，从而减少ATP合成，并以热能的形式散失。正常情况下，UCP-2会维持细胞对能量的需求，但当能量需求增加时(例如在缺血再灌注期间)，激活的UCP-2会导致ATP合成的下降^[10]。研究发现，在脂肪变性的情况下，肝细胞中UCP-2的表达水平是正常肝脏的4~6倍^[11]。因此，当脂肪肝细胞在经历缺血再灌注时，ATP耗损将远远高于正常肝脏细胞，从而导致脂肪肝细胞发生大量的坏死^[12]。这解释了脂肪肝细胞在经历IRI后更容易发生细胞坏死，而不是凋亡，因为细胞凋亡是一个需要能量的过程，而脂肪变性肝脏在经历缺血再灌注后ATP水平严重下降，所以导致凋亡通路被抑制，细胞发生坏死。

由上可知，肝脏IRI所导致的线粒体功能障碍最终会诱导肝细胞的死亡。研究发现，线粒体通透性转换(MPT)是介导肝脏IRI后细胞死亡的关键环节^[13]。在缺血再灌注过程中，由于细胞内ROS增加、Ca²⁺浓度升高以及线粒体基质中无机磷的增加等条件，线粒体内膜发生通透性转变，线粒体通透性转换孔(mPTP)的开放导致小分子和水的通过，这会引起线粒体基质肿胀和外膜的破裂，线粒体膜间隙的凋亡诱导因子(AIF)、细胞色素C和促凋亡因子(Smac/DIABLO)也随之释放^[14]。这些蛋白一旦被释放到胞质中，就可以激活Caspase依赖型细胞凋亡通路或者非Caspase依赖型的细胞坏死通路^[14]。最近研究表明，MPT也在脂肪变性肝脏的IRI中发挥重要作用^[15]。然而，脂肪变性肝脏中MPT的启动条件与正常肝脏相比略有不同。Xue等^[15]实验表明，对脂肪肝细胞肉碱棕榈酰转移酶1A(CPT1A)的抑制促进了细胞内氯离子通道蛋白1(CLIC1)从胞质向胞膜的移位，从而形成氯离子通道，加剧了细胞内Cl^-的积累，引发mPTP开放，加剧了细胞的氧化应激和能量耗竭，最终导致脂肪肝细胞的损伤。上述实验表明，Cl^-积累在脂肪肝细胞中MPT的启动也发挥重要作用。

内质网(endoplasmic reticulum，ER)是蛋白质加工的主要场所，当细胞外界环境发生改变时，ER腔内的蛋白负荷超出了其对蛋白折叠和修饰的能力范围时，末折叠蛋白就会积累，就会发生ER应激，从而清除ER腔内错误折叠的蛋白。但持续、剧烈的内质网应激就会诱导细胞发生凋亡^[16]。研究表明，ER应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)是参与肝脏IRI过程的重要环节^[17]。当肝细胞受到缺血再灌注的刺激时，内质网稳态发生破坏，引发ERS。

大量的未折叠蛋白的聚集驱动分子伴侣免疫球蛋白结合蛋白/葡萄糖调节蛋白78(BiP/GRP78)与转录激活因子6(ATF6)、需肌醇酶1α(IRE1α)和蛋白激酶R样ER激酶(PERK)解离，进而触发下游三条信号转导通路^[18]。其中，IRE1α可以启动X-box结合蛋白1(XBP1)的mRNA的剪接，并转位到细胞核中，从而参与ER相关性降解(ERAD)机制，增强ER和未折叠蛋白的清除。PERK可以磷酸化真核翻译起始因子2α(eIF2α)并使其失活，减少蛋白质翻译，阻止新的蛋白分子进入ER，从而减轻ER内蛋白的负荷。与BiP/GRP78解离后，ATF6移动到高尔基体，并被Site-1和Site-2蛋白酶切割成具有转录活性的多肽，移位到细胞核，进而上调ER分子伴侣和ERAD因子等的转录，从而增加蛋白质的折叠能力^[18]。

目前，人们已证明ERS在脂肪变性肝脏IRI中起重要作用^[19,20,21]。Ben Mosbah等^[19]研究表明，经历缺血60 min联合70%重度大泡性脂肪变性肝脏(60%~70%)切除的大鼠模型可诱导IRE1α和PERK通路的激活，但不能诱导ATF6通路的激活，这与正常肝脏对IRI的反应不同。激活的IRE1α与肿瘤坏死因子受体相关因子2(TRAF2)结合，激活c-Jun氨基末端激酶和caspase-12。同时，磷酸化PERK诱导下游elF2α的α亚基磷酸化，并上调转录激活子4(ATF4)和C/EBP同源蛋白-10(CHOP)的表达，引起细胞凋亡。另有研究表明，在脂肪肝的发生过程中，Kupffer细胞内ERS被激活^[20]。激活的ERS通过改变Kupffer细胞的免疫功能进而加重脂肪肝IRI。下调Kupffer细胞内的IRE1α信号通路可显著抑制信号转导及转录激活因子(STAT)1，并激活STAT6，从而促进Kupffer细胞M2型表型转化，减轻脂肪肝的IRI。这可能是因为M2型Kupffer细胞具有抗炎和修复作用。牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)作为一种ERS抑制剂，可以通过抑制IRE1α和PERK通路来减轻脂肪肝IRI。TUDCA可以降低核因子(NF)-κB活性及IL-6和IL-1β水平，减轻炎症反应^[21]。

早期研究发现，ERS信号可导致自噬作用增强^[22]。有证据表明，脂肪变性肝脏对IRI的敏感性升高与自噬改变存在直接联系^[23,24]。Zaouali等^[23]研究表明，在IGL-1器官保存溶液中，联合添加曲美他嗪和褪黑激素可以激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)，减轻内质网应激反应并升高肝脏细胞的自噬水平，从而减少重度大泡性脂肪肝(60%~70%)冷IRI。Zhang等^[24]实验证明，中度脂肪变性供肝(40%~60%)移植可以通过内质网应激诱导内质网自噬的发生，而小檗碱(Berberine)可以抑制此过程，从而对脂肪变性供肝移植进行保护。

过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)是一种核内受体转录因子，它是调节目的基因表达的核受体超家族成员。它由PPARα、PPARγ和PPARβ/δ三种异构体组成，其中PPARα和PPARγ被证明是中度大泡性脂肪变性肝IRI的重要调节因子^[25,26]。在非酒精性单纯性脂肪肝和非酒精性脂肪性肝炎中，使用PPARα激活剂WY-14643可以减轻肝脏IRI，其作用机制一方面是通过抑制黏附分子和细胞因子反应，另一方面是激活NF-κB和IL-6的产生而实现^[27]。另外，PPARα激动剂以及缺血预处理(PC)可以抑制重度脂肪变性肝脏(60%~70%脂肪变性)IRI后丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)的表达，从而抑制肝脏内脂联素的积累，减轻氧化应激对肝脏的损伤^[28]。动物实验表明，IL-6使用可提高重度脂肪变性肝脏PPARα水平，降低肝脏内血清肿瘤坏死因子(TNF)-α水平，可降低重度脂肪变性肝脏对热IRI的敏感性^[29]。

与PPARα在脂肪肝IRI中的激活作用不同，PPARγ拮抗剂在保护脂肪肝IRI方面是有效的。实验人员将ERS抑制剂TUDCA添加到UW保存液中6 h后发现，其可以降低PPARγ水平，上调Toll样受体4(TLR4)，特别是TIR结构域接头蛋白(TRIF)途径，从而减轻了中度大泡性脂肪变性(40%~60%)肝移植物的损伤，而PPARγ激动剂(罗格列酮)的加入则消除了TUDCA的这种作用^[25]。另外，在肥胖的Zucker大鼠肝移植模型中，中度大泡性脂肪变性肝脏中的PPARγ蛋白水平显著高于假手术组，中度大泡性脂肪变性肝脏中PPARγ拮抗剂预处理以剂量依赖的方式减轻了移植肝脏IRI损伤^[26]。然而，Casillas-Ramirez等^[30]实验结果显示，如果PPARγ活性被抑制，缓激肽(BK)则无法通过PPARγ对重度脂肪变性肝脏(60%~70%脂肪变性)IRI进行保护。相反，如果PPARγ活性没有被抑制，BK则可以通过诱导PPARγ过度表达，进而对肝脏IRI过程进行保护。另外，表皮生长因子通过促进重度脂肪变性肝脏(60%~70%脂肪变性)中PPARγ的过表达来对其IRI过程产生保护^[31]。因此，我们仍需要进一步研究来确定PPARγ在肝脏脂肪变性IRI中的作用。

TLR4是TLR受体超家族的一员，被配体激活后可产生促炎细胞因子和炎症趋化因子，调节天然免疫，防止微生物入侵。已有研究报道称TLR4信号通路与肝脏IRI有关^[32]。TLR4信号通路是由两种不同的细胞内接头蛋白介导的：髓样分化因子88(MyD88)和TIR结构域接头蛋白诱导的IFNβ(TRIF)。这两个分子激活细胞内的信号级联，最终通过释放TNF-α、IL-6、IFNβ和IFNγ来触发炎症反应。阻断TLR4信号可以降低肝脏缺血再灌注早期的促炎反应，减轻其损伤程度^[32]。

最近研究显示，TLR4/NF-κB通路参与了脂肪肝的IRI^[33,34]。Zhang等^[33]的实验表明，TLR4基因敲除明显抑制了IL-6和TNF-α的表达，上调了非酒精性脂肪肝和缺血再灌注复合模型中线粒体融合素基因2(Mfn2)和过氧化物酶体增殖物激活受体-γ共激活因子-1α(PGC-1α)的表达，使线粒体融合增加，ATP消耗和ROS生成明显减少。Kron等^[34]实验表明在严重脂肪变性(≥60%脂肪变性)肝移植再灌注过程中，TLR4以危险/损害相关分子模式(DAMP)识别内源性配体-高迁移率族蛋白B1(HMGB-1)。肝细胞中产生ROS氧化了细胞DNA并产生8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)，从而释放HMGB-1。HMGB-1和TLR4相结合诱导MyD88依赖的通路信号，释放炎性细胞因子TNF-α、IL-6并激活内皮细胞。冷保存后经过低温携氧机械灌注(HOPE)1 h处理可以防止原位肝移植后早期的ROS和DAMP释放，从而减少下游各种炎症通路的激活。

最近的研究表明，IGL-1保存液对冷保存脂肪肝移植的缺血再灌注保护作用明显优于HTK液和UW液，这种保护效果可能与IGL-1溶液中含有的致癌剂PEG35相关^[35,36]。它会激活AMPK、稳定细胞ATP含量和表达e-NOS，抑制蛋白质泛素化和UPS活性，从而减少与冷缺血相关的脂肪肝损伤。另外，添加硼替佐米(BRZ)的IGL-1溶液可诱导GSK3β磷酸化，从而降低细胞色素C的释放和caspase-3裂解水平，减少细胞凋亡。Ramachandran等^[37]实验证明脂肪变性肝移植IRI与NF-κB亚单位p65的过度激活有关，对脂肪变性供肝蛋白酶体抑制可减少NF-κB p65活化和促炎因子的释放，改善肝脏脂肪变性大鼠的移植效果。这些研究表明，蛋白酶体抑制剂的使用有助于在器官保存液中维持生理性的泛素-蛋白结合库，从而延长脂肪变性移植肝脏的保存时间，减轻随后的冷IRI。另有实验表明，蛋白酶体抑制剂MG132可以通过调节大鼠肝脏热缺血再灌注后的氧化/抗氧化状态，从而在再灌注早期发挥保护作用^[38]。但是在脂肪肝IRI中的作用有待进一步研究。

实验研究表明，肝脏脂肪变性的程度与其微循环障碍有关^[39]。肝细胞胞质内脂滴积聚引起细胞体积增大，导致肝窦间隙部分或完全阻塞，肝窦血流阻力增加。在再灌注过程中，纤维蛋白微血栓和细胞碎片使窦腔变窄，进一步降低了窦腔的灌注^[39]。脂肪肝细胞持续处于相对缺血缺氧状态，使脂肪肝患者易受IRI。

El-Badry等^[40]研究表明，脂肪变性小鼠肝脏中ω-6：ω-3多不饱和脂肪酸的比例较高，缺血再灌注后可引起微血管紊乱。ω-3脂肪酸可减少脂肪变性肝脏缺血再灌注后血栓素A2(TXA2)的产生。TXA2是一种血管活性促炎脂质介质，降低的TXA2水平与再灌注后容积血流量的改善有关，这可以减轻脂肪变性肝脏IRI。

肝星状细胞(HSCs)可以通过自身的收缩或松弛来调节肝窦腔的直径，从而影响肝脏微循环，这是通过Rho信号通路调节的。研究表明，脂肪变性肝脏中HSCs的激活与ROCK2的上调有关，ROCK2的激活参与了脂肪变性肝脏IRI^[41]。

另有一项研究显示，脂肪变性肝脏在经历IRI后，炎症反应被减弱(包括中性粒细胞浸润)，而脂肪变性肝脏损伤加重与整个肝脏血流量和肝血窦灌注的显著减少相关。这表明肝脏血流受损是造成脂肪变性肝脏IRI加重的关键因素，减少缺血再灌注损伤的一种方法是限制肝脏缺血时间^[42]。

HO-1是光滑内质网的I型跨膜蛋白，它是组织和器官在炎症和缺血等应激条件下活化的关键细胞保护机制^[43]。其中，血红素加氧酶-1/核因子E2相关因子2(HO-1/ Nrf2)信号轴在脂肪肝IRI中发挥重要作用^[44]。虾青素(ASTX)可以通过抑制ROS产生和炎性细胞因子表达，诱导Kupffer细胞HO-1和Nrf-2表达并且使MAPK通路失活，从而对脂肪肝IRI起到保护作用^[45]。Ahmed等^[46]研究发现，在常温机械灌注期间使用Nrf2激动剂，可以增加肝细胞HO-1/ Nrf2的表达，减少脂肪肝IRI。另外，高表达Nrf2的供肝组织转氨酶水平、肝血管炎症及门静脉周围CD3⁺ T细胞浸润显著降低，并且在使用常温机械灌注之后，高表达Nrf2的供肝组织可显著减少转氨酶改变并改善乳酸清除率。

Sirt1是一种依赖NAD⁺的蛋白去乙酰化酶，参与细胞应激反应、葡萄糖稳态和免疫反应等多种生理过程。Zhang等^[47]的数据显示，肾酶(RNLS)在中度脂肪变性肝脏(60%脂肪变性)中表达下调，RNLS通过激活Sirt1减少ROS的产生，改善线粒体功能，从而有效地减轻肝脏IRI。此外，RNLS的下调是通过STAT3的表达减少而实现的。Pantazi等^[48]的研究证实PPARα激动剂WY-14643可以通过诱导Sirt1来抑制ERS的发生，从而保护脂肪肝大鼠IRI。

随着单细胞RNA测序(scRNA-Seq)技术的大力发展，人们可以从更全面角度分析疾病细胞分子的异质性。Yang等^[49]对小鼠中度脂肪肝移植细胞和正常小鼠肝移植细胞进行了全面的scRNA-Seq分析比较，发现移植脂肪变性肝脏中富含集落刺激因子3(CSF3)的Kupffer cells(KCs)的致炎表型参与了脂肪移植物损伤。他们还检测到高表达趋化因子受体XCR1的树突状细胞(DC)亚群，在连接先天免疫反应和获得性免疫反应中起着至关重要的作用，并介导了更严重的脂肪肝IRI。这些结果促进了人们对不同供者来源之间异质性的认识，为肝移植中脂肪变性供肝的个体化治疗提供了依据。

目前，人们对脂肪变性肝脏对IRI易感性的分子和细胞机制有了越来越多的了解。研究人员已经开发了包括缺血预处理和药物预处理等治疗方法来保护脂肪变性的肝脏IRI。然而，其临床应用还很遥远，大多数讨论的研究都集中在小鼠肝脏节段性热缺血再灌注的原位模型中进行，尚未证实其在大型动物甚至人类中的分子作用机制。因此，需要对脂肪肝IRI的潜在机制进行更多的研究，以便开发新的预防和治疗策略来提高脂肪变性供肝移植成功率，从而解决供肝匮乏等问题。